导痰汤对大鼠脑血管内皮细胞细胞间粘附分子-1的影响
收藏
打印
发给朋友
发布者：陈文强 李宗信 黄小波 王宁群 李斌
热度0票 浏览75次
时间：2011年5月12日 10:03
【摘要】 ：目的 对导痰汤干预脑血管内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的表达进行研究。方法 通过脑血管内皮细胞培养,采用免疫组织化学方法观察肿瘤坏死因子α(TNF-α)在不同时程(0～24 h)对内皮细胞ICAM-1表达的影响,以及导痰汤的干预情况。结果 随着TNF-α作用时程增加,内皮细胞ICAM-1表达显著上调,呈时间依赖性,P<0.05。预先使用导痰汤处理内皮细胞后,ICAM-1表达无显著性变化,与模型组比较,P<0.05。结论 导痰汤能对不同时程的TNF-α诱导ICAM-1高表达发挥抑制作用。
职称论文发表网
【关键词】 导痰汤 脑血管内皮细胞 细胞间粘附分子-1 大鼠
Abstract：Objective To study the intervention of Daotan Decoction to the expression of ICAM-1 in cerebrovascular endothelial cells. Methods Cerebrovascular endothelial cells were cultured to observed the influence of ICAM-1 expression, which was induced by TNF-α, by the way of immunocytochemistry methods. Results Compared with control group, the expression of ICAM-1 in model group was time-dependent (P<0.05). And compared with model group, Daotan Decoction could significantly restrain ICAM-1 expression (P<0.05). Conclusion Daotan Decoction could restrain ICAM-1 expression induced by TNF-α in different phase.
Key words：Daotan Decoction；cerebrovascular endothelial cell；ICAM-1；rat
单核细胞在血管内皮粘附并向内皮下迁移和泡沫化是动脉粥样硬化早期的病理过程[1]。细胞间粘附分子-1(ICAM-1)几乎参与了单核细胞粘附和迁移转化的全过程,促进和加速了脑动脉粥样硬化的发生和发展,与脑动脉硬化的发生、发展有重要关系[2]。由于ICAM-1作为表达于细胞表面的可诱导的糖蛋白,在脑动脉粥样硬化病理过程中起着重要的作用,因此,恰当地影响其表达可能对脑动脉粥样硬化具有治疗作用。本实验用免疫组化法检测导痰汤对大鼠脑血管内皮细胞ICAM-1表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性SD大鼠,体重180～200 g,北京维通利华实验动物技术公司提供,合格证号：SCXK(京)2002-0003。
1.2 含药血清制备
健康雄性SD大鼠5只,使用导痰汤灌胃,给药剂量为0.9 g/(kg·d),每日2次,每次3 mL,连续10 d。于末次给药后1 h麻醉,无菌条件下经腹主动脉采血,分离血清,56 ℃灭活30 min,分装冻存备用。另取雄性SD大鼠5只,以等体积生理盐水灌胃,所取血清作为对照使用。
1.3 脑血管内皮细胞培养
取100 g雄性SD大鼠10只,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,断头处死,无菌条件下分离鼠脑,75%酒精浸泡,置于10%小牛血清的D-hank’s液内。收集大脑皮质,匀浆,80 μm尼龙网过滤,离心。用0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶37 ℃消化20 min,过滤,分离的细胞悬于含20%小牛血清RPMI-1640培养基。将细胞接种于预先用0.2%明胶包被的聚苯乙烯培养皿中, 37 ℃培养6 h,更换含10 mg/L内皮细胞生长因子的RPMI-1640完全培养基培养。每3 d换液1次,直至长成细胞单层,用0.25%胰蛋白酶消化备用。台盼蓝染色并记数后,将细胞按照105/mL的密度接种于BIO-RAD 8孔培养板内,37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。通过第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RA)免疫组化阳性检验,证实为血管内皮细胞。
职称论文发表网
1.4 分组
将培养的内皮细胞随机分为3个组。对照组；TNF-α组：TNF-α的浓度为100 U/mL(作用时间2、4、6、12、24 h)；导痰汤＋TNF-α组：含药血清浓度为10%,预先作用时间6 h,其余同TNF-α组。
1.5 SABC免疫组织化学法检测细胞间粘附分子-1
X-100 Tris HCl 6 h；PBS洗(10 min×2),山羊血清封闭20 min,兔抗大鼠ICAM-1抗体(1∶100)37 ℃ 1 h,生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 20 min,PBS洗(10 min×2),SABC 37 ℃ 45 min, DAB显色。阴性对照用PBS分别代替一抗、二抗,结果为阴性。随机选择ICAM-1蛋白反应阳性细胞,高彩色病理图文分析系统扫描,测定积分光密度。
1.6 统计学方法
实验数据以—x±s表示,实验组与对照组之间用t检验分析差异的显著性,观察随时间变化的趋势用方差分析。
2 结果
免疫组化染色显示,ICAM-1阳性细胞膜全部或部分成浅褐色,ICAM-1表达增强表现为ICAM-1阳性细胞密度增加或膜着色加深。TNF-α组与对照组比较,随着TNF-α作用时程增加,内皮细胞ICAM-1表达上调更显著,呈时间依赖性(P<0.05)。预先使用导痰汤处理内皮细胞后,再用TNF-α刺激相同时间,ICAM-1表达无显著性变化,与对照组比较,P<0.05。结果见表1。表1 导痰汤不同作用时间对ICAM-1表达的影响(略)注：与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与本组2、4 h比较,△P<0.05,△△P<0.01
3 讨论
根据脑动脉粥样硬化典型临床表现,将其归属于中医学“眩晕”、“头痛”等范畴,并根据“无痰不作眩”等病机理论,将化痰法在脑动脉粥样硬化治疗中加以运用,取得了一定的疗效。但是临床多将化痰与祛瘀并用,难以区分痰和瘀在脑动脉粥样硬化发病过程中的具体作用机理,以及中药干预的途径。我们在前期对脑动脉粥样硬化的研究发现痰证的发生率为19.39%,在脑动脉粥样硬化所有中医证型中排第２位[3],因此,有必要对导痰汤等化痰法治疗脑动脉粥样硬化的机理进行研究。
ICAM-1属于免疫球蛋白超基因家族,主要分布于白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、某些肿瘤细胞和肝细胞。ICAM-1表达的异常能促进或加剧动脉粥样硬化等多种疾病发生和发展[4]。ICAM-1是内皮细胞活化标志之一,在中性粒细胞迁移和内皮细胞粘附致脑动脉硬化过程中起重要作用[5]。本实验参照中性粒细胞迁移的研究方法[6],使用TNF-α作为血管内皮细胞活化的刺激因子,观察导痰汤对ICAM-1表达的影响。实验结果显示,对照组大鼠脑血管内皮细胞有ICAM-1微量表达, TNF-α组内皮细胞ICAM-1表达明显增加,使用导痰汤干预后,大鼠内皮细胞ICAM-1表达明显下降,基本恢复正常水平。这表明,导痰汤作为临床常用化痰名方,能有效抑制因TNF-α刺激所致的脑血管内皮细胞ICAM-1的表达。
本实验发现,TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达上调呈时间依赖性,且维持高表达水平至少达24 h。一方面说明TNF-α直接参与诱导ICAM-1表达；另一方面,TNF-α在各炎症阶段对ICAM-1发挥不同的诱导作用。因此,作为一种重要的致炎因子,TNF-α可能在脑动脉硬化不同时程部分通过ICAM-1的诱导而体现不同的致炎特性。而导痰汤则对不同时程的TNF-α诱导ICAM-1高表达发挥抑制作用,这可能与中药多成分多靶点的药理特性有一定的关系。
另外,ICAM-1分布于细胞表面和细胞间基质,在脑动脉粥样硬化过程中,以受体-配体形式发挥作用,介导细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞间的粘附,参与细胞的信号传递与活化、炎症等一系列重要生理和病理过程。这与痰性粘滞,易阻碍气机,遍布周身上下的特性有一定相似性[7]。因此,有理由认为,痰作为中医病理产物和致病因素,在脑动脉粥样硬化发病过程中不但起了重要作用,而且与内皮细胞粘附分子之间存在某种联系。而导痰汤在临床上用于治疗脑动脉粥样硬化时,则是至少通过抑制内皮细胞粘附分子的表达而发生作用的。
职称论文发表网
【参考文献】
[1] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423)：801－809.
[2] Norbert Nighoghossian, Laurent Derex, Philippe Douek. The vulnerable carotid artery plaque：current imaging methods and new perspectives[J].Stroke,2005,36(12)：2764－2772.
[3] 李宗信,黄小波,陈文强.脑动脉硬化的中医聚类分型[J].中国中医药信息杂志,2005,12(12)：15－16.
[4] Shimizu N,Suzuki H,Wakabayashi K,et al.Expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation[J].J Cardiol,2004,43(3)：131－139.
[5] Sadowska AM,Van Overveld FJ,Luyten C,et al.Use of ICAM-1 antibodies and antisense oligonucleotides to inhibit transmigration of neutrophils[J].Inflamm Res,2004,53(4)：143－1491.
[6] Asimakopoulos G, Thompson R, Nourshargh S, et al. An anti- inflammatoryproperty of aprotinin detected at the level of leukocyte extravasation[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2001,120(2)：361－369.
[7] 张茂华,金国健,樊锦秀,等.老年人痰浊阻遏证组三种血清粘附分子表达的研究[J].深圳中西医结合杂志,2005,15(5)：281－283.
职称论文发表网
【关键词】 导痰汤 脑血管内皮细胞 细胞间粘附分子-1 大鼠
Abstract：Objective To study the intervention of Daotan Decoction to the expression of ICAM-1 in cerebrovascular endothelial cells. Methods Cerebrovascular endothelial cells were cultured to observed the influence of ICAM-1 expression, which was induced by TNF-α, by the way of immunocytochemistry methods. Results Compared with control group, the expression of ICAM-1 in model group was time-dependent (P<0.05). And compared with model group, Daotan Decoction could significantly restrain ICAM-1 expression (P<0.05). Conclusion Daotan Decoction could restrain ICAM-1 expression induced by TNF-α in different phase.
Key words：Daotan Decoction；cerebrovascular endothelial cell；ICAM-1；rat
单核细胞在血管内皮粘附并向内皮下迁移和泡沫化是动脉粥样硬化早期的病理过程[1]。细胞间粘附分子-1(ICAM-1)几乎参与了单核细胞粘附和迁移转化的全过程,促进和加速了脑动脉粥样硬化的发生和发展,与脑动脉硬化的发生、发展有重要关系[2]。由于ICAM-1作为表达于细胞表面的可诱导的糖蛋白,在脑动脉粥样硬化病理过程中起着重要的作用,因此,恰当地影响其表达可能对脑动脉粥样硬化具有治疗作用。本实验用免疫组化法检测导痰汤对大鼠脑血管内皮细胞ICAM-1表达的影响。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性SD大鼠,体重180～200 g,北京维通利华实验动物技术公司提供,合格证号：SCXK(京)2002-0003。
1.2 含药血清制备
健康雄性SD大鼠5只,使用导痰汤灌胃,给药剂量为0.9 g/(kg·d),每日2次,每次3 mL,连续10 d。于末次给药后1 h麻醉,无菌条件下经腹主动脉采血,分离血清,56 ℃灭活30 min,分装冻存备用。另取雄性SD大鼠5只,以等体积生理盐水灌胃,所取血清作为对照使用。
1.3 脑血管内皮细胞培养
取100 g雄性SD大鼠10只,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,断头处死,无菌条件下分离鼠脑,75%酒精浸泡,置于10%小牛血清的D-hank’s液内。收集大脑皮质,匀浆,80 μm尼龙网过滤,离心。用0.2%胶原酶和0.1%胰蛋白酶37 ℃消化20 min,过滤,分离的细胞悬于含20%小牛血清RPMI-1640培养基。将细胞接种于预先用0.2%明胶包被的聚苯乙烯培养皿中, 37 ℃培养6 h,更换含10 mg/L内皮细胞生长因子的RPMI-1640完全培养基培养。每3 d换液1次,直至长成细胞单层,用0.25%胰蛋白酶消化备用。台盼蓝染色并记数后,将细胞按照105/mL的密度接种于BIO-RAD 8孔培养板内,37 ℃、5% CO2培养箱内孵育。通过第Ⅷ因子相关抗原(FⅧ-RA)免疫组化阳性检验,证实为血管内皮细胞。
职称论文发表网
1.4 分组
将培养的内皮细胞随机分为3个组。对照组；TNF-α组：TNF-α的浓度为100 U/mL(作用时间2、4、6、12、24 h)；导痰汤＋TNF-α组：含药血清浓度为10%,预先作用时间6 h,其余同TNF-α组。
1.5 SABC免疫组织化学法检测细胞间粘附分子-1
X-100 Tris HCl 6 h；PBS洗(10 min×2),山羊血清封闭20 min,兔抗大鼠ICAM-1抗体(1∶100)37 ℃ 1 h,生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃ 20 min,PBS洗(10 min×2),SABC 37 ℃ 45 min, DAB显色。阴性对照用PBS分别代替一抗、二抗,结果为阴性。随机选择ICAM-1蛋白反应阳性细胞,高彩色病理图文分析系统扫描,测定积分光密度。
1.6 统计学方法
实验数据以—x±s表示,实验组与对照组之间用t检验分析差异的显著性,观察随时间变化的趋势用方差分析。
2 结果
免疫组化染色显示,ICAM-1阳性细胞膜全部或部分成浅褐色,ICAM-1表达增强表现为ICAM-1阳性细胞密度增加或膜着色加深。TNF-α组与对照组比较,随着TNF-α作用时程增加,内皮细胞ICAM-1表达上调更显著,呈时间依赖性(P<0.05)。预先使用导痰汤处理内皮细胞后,再用TNF-α刺激相同时间,ICAM-1表达无显著性变化,与对照组比较,P<0.05。结果见表1。表1 导痰汤不同作用时间对ICAM-1表达的影响(略)注：与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；与本组2、4 h比较,△P<0.05,△△P<0.01
3 讨论
根据脑动脉粥样硬化典型临床表现,将其归属于中医学“眩晕”、“头痛”等范畴,并根据“无痰不作眩”等病机理论,将化痰法在脑动脉粥样硬化治疗中加以运用,取得了一定的疗效。但是临床多将化痰与祛瘀并用,难以区分痰和瘀在脑动脉粥样硬化发病过程中的具体作用机理,以及中药干预的途径。我们在前期对脑动脉粥样硬化的研究发现痰证的发生率为19.39%,在脑动脉粥样硬化所有中医证型中排第２位[3],因此,有必要对导痰汤等化痰法治疗脑动脉粥样硬化的机理进行研究。
ICAM-1属于免疫球蛋白超基因家族,主要分布于白细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、某些肿瘤细胞和肝细胞。ICAM-1表达的异常能促进或加剧动脉粥样硬化等多种疾病发生和发展[4]。ICAM-1是内皮细胞活化标志之一,在中性粒细胞迁移和内皮细胞粘附致脑动脉硬化过程中起重要作用[5]。本实验参照中性粒细胞迁移的研究方法[6],使用TNF-α作为血管内皮细胞活化的刺激因子,观察导痰汤对ICAM-1表达的影响。实验结果显示,对照组大鼠脑血管内皮细胞有ICAM-1微量表达, TNF-α组内皮细胞ICAM-1表达明显增加,使用导痰汤干预后,大鼠内皮细胞ICAM-1表达明显下降,基本恢复正常水平。这表明,导痰汤作为临床常用化痰名方,能有效抑制因TNF-α刺激所致的脑血管内皮细胞ICAM-1的表达。
本实验发现,TNF-α能使培养的血管内皮细胞ICAM-1表达上调呈时间依赖性,且维持高表达水平至少达24 h。一方面说明TNF-α直接参与诱导ICAM-1表达；另一方面,TNF-α在各炎症阶段对ICAM-1发挥不同的诱导作用。因此,作为一种重要的致炎因子,TNF-α可能在脑动脉硬化不同时程部分通过ICAM-1的诱导而体现不同的致炎特性。而导痰汤则对不同时程的TNF-α诱导ICAM-1高表达发挥抑制作用,这可能与中药多成分多靶点的药理特性有一定的关系。
另外,ICAM-1分布于细胞表面和细胞间基质,在脑动脉粥样硬化过程中,以受体-配体形式发挥作用,介导细胞与细胞间、细胞与基质间或细胞-基质-细胞间的粘附,参与细胞的信号传递与活化、炎症等一系列重要生理和病理过程。这与痰性粘滞,易阻碍气机,遍布周身上下的特性有一定相似性[7]。因此,有理由认为,痰作为中医病理产物和致病因素,在脑动脉粥样硬化发病过程中不但起了重要作用,而且与内皮细胞粘附分子之间存在某种联系。而导痰汤在临床上用于治疗脑动脉粥样硬化时,则是至少通过抑制内皮细胞粘附分子的表达而发生作用的。
职称论文发表网
【参考文献】
[1] Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s[J].Nature,1993,362(6423)：801－809.
[2] Norbert Nighoghossian, Laurent Derex, Philippe Douek. The vulnerable carotid artery plaque：current imaging methods and new perspectives[J].Stroke,2005,36(12)：2764－2772.
[3] 李宗信,黄小波,陈文强.脑动脉硬化的中医聚类分型[J].中国中医药信息杂志,2005,12(12)：15－16.
[4] Shimizu N,Suzuki H,Wakabayashi K,et al.Expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation[J].J Cardiol,2004,43(3)：131－139.
[5] Sadowska AM,Van Overveld FJ,Luyten C,et al.Use of ICAM-1 antibodies and antisense oligonucleotides to inhibit transmigration of neutrophils[J].Inflamm Res,2004,53(4)：143－1491.
[6] Asimakopoulos G, Thompson R, Nourshargh S, et al. An anti- inflammatoryproperty of aprotinin detected at the level of leukocyte extravasation[J].J Thorac Cardiovasc Surg,2001,120(2)：361－369.
[7] 张茂华,金国健,樊锦秀,等.老年人痰浊阻遏证组三种血清粘附分子表达的研究[J].深圳中西医结合杂志,2005,15(5)：281－283.
