华支睾吸虫乳酸脱氢酶E10-20及E94-102表位的克隆表达与生物学特性初步研究

             作者：黄灿 王乐旬 胡旭初 余新炳 黄艳 邓传欢 徐劲

【摘要】  【目的】 原核克隆及表达华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)两个表位aa10-20(E10-20)及aa94-102(E94-102)，初步研究两表位与CsLDH免疫学及酶学相互关系。【方法】 将E10-20及E94-102克隆至pGEX-4T-1载体，表达纯化重组蛋白，用Western Blotting和间接ELISA法检测CsLDH免疫血清对表位重组蛋白的识别，同时检测两表位重组蛋白的免疫血清对CsLDH蛋白的识别;利用CsLDH标准酶活性反应体系，比较两表位免疫血清与CsLDH免疫血清对CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸反应的影响。【结果】 成功构建pGEX-4T-1-E10?鄄20及pGEX-4T-1-E94-102重组质粒，SDS-PAGE鉴定表达的重组蛋白，菌体裂解液经亲和层析纯化，获得与GST融合表达的蛋白E10-20及E94-102。两表位重组蛋白均可被CsLDH免疫血清识别，而对E94-102更易于识别;重组CsLDH也能被E10-20及E94-102免疫血清识别，而不能被对照血清识别。E94-102免疫血清能抑制CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的反应。【结论】 表位结构和功能研究深化了对CsLDH结构的理解，并为开辟CsLDH疫苗研究新路径奠定基础。 文学论文发表

【关键词】  华支睾吸虫; 乳酸脱氢酶; 表位

　Abastract： 【Objective】 To clone and prokaryotically express the two epitopes aa10-20(E10-20) and aa94-102(E94-102) of CsLDH from Clonorchis sinensis， then to study the relationship between the two epitopes and CsLDH basically. 【Methods】 E10-20 and E94-102 were cloned to pGEX-4T-1 vector， then the recombinant protein were expressed and purified. CsLDH immunized sera was used as the first antibody， two epitopes were identified by Western blotting and IgG-ELISA analysis. E10-20 and E94-102 immunized sera was used as the first antibody， CsLDH was identified by the same methods above. Enzyme activity of recombinant CsLDH was assayed in the standard reaction system by adding different dilution sera. 【Results】 The recombinant plasmids pGEX-4T-1-E10-20 and pGEX-4T-1-E94-102 were constructed successfully. The expression products and purified ones were identified by SDS-PAGE. Western blotting and ELISA both showed that the CsLDH immunized sera could identify the two epitopes and E94-102 more easily. Epitopes immunized sera both could identify CsLDH by Western blotting and ELISA analysis. E94-102 immunized sera could inhibit the CsLDH enzyme activity as the CsLDH immunized sera could do. 【Conclusion】 Construction and function of the two epitopes helps to understand the construction of CsLDH and supply new methods to the vaccine study of the CsLDH.文学论文发表

　　华支睾吸虫病是由华支睾吸虫囊蚴感染宿主所引起的一种人兽共患寄生虫病。本实验室近年来开展对于华支睾吸虫功能基因组研究，表膜蛋白在疫苗研究中的价值初显[1-3]。我们对华支睾乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase from Clonorchis sinensis，CsLDH)的研究中，发现此酶能表达在华支睾吸虫表膜上，且该酶分子为厌氧代谢的关键酶分子，因而其结构与功能特点使其很有可能成为一个有价值的疫苗候选分子[4-5]。表位是蛋白质抗原性的基础，深入研究蛋白质的表位对蛋白质的结构和新型疫苗分子的设计具有重要价值[6-8]。我们运用Pcgene软件分析获得CsLDH的3个重要的表位：aa10-18，aa12-20和aa94-102。aa10-18和aa12-20为连续的亲水线性表位，遂命名为E10-20;aa94-102则命名为E94-102;理论预测E94-102位于膜外区，三维空间上构成一个抗原结合环，Arg102为CsLDH催化中心中3个必须氨基酸之一。我们推测针对该表位的抗体可能对CsLDH的结构与功能产生影响[4]。作者经人工合成E10-20及E94-102基因序列，将其克隆至pGEX-4T-1载体，使短肽表达在GST蛋白末端，与原核表达的CsLDH进行对比研究，探讨CsLDH结构特征及线性表位对于CsLDH功能的影响。文学论文发表

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　大肠杆菌DH5α/DE3、BL21/DE3由本室保存;原核表达载体pGEX-4T-1购自Pharmasis公司，由本实验室常规保存。清洁级雄性SD大鼠由中山大学实验动物中心提供。

　　1.2 试 剂

　　BamHⅠ、XhoⅠ和T4DNA连接酶购自Promega公司;质粒提取和凝胶回收试剂盒为北京赛百盛公司产品;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、丙酮酸(pyruvate)、和还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)均为Sigma公司产品;PVDF膜为Millipore公司产品;HRP标记的山羊抗大鼠IgG(H + L)、DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品。文学论文发表

　　1.3 方 法

　　1.3.1 目的基因获取

　　根据表位DNA序列及克隆载体pGEX-4T-1多克隆酶切位点设计目的基因。E10-20，P：5′-gatccCCAGCTGATGCTAGATCTCGC CCGAGGACGAAGTAAc-3′;N：5′-tcgagTTACTTCG TCCTCGGGCGAGATCTAGCATCAGCTGGg-3′;E94-102，P： 5′-gatccGCTCGTCAGAATGAAGGAGAATCCAG GTAAc-3′;N：5′-tcgagTTACCTGGATTCTCCTTCAT TCTGACGAGCg-3′;其中，P：5′端下划线所示序列为BamHⅠ限制性核酸内切酶所识别序列(gatccg)经该酶酶切后序列，P：3′端下划线所示序列为XhoⅠ限制性核酸内切酶所识别序列(gtcgag)经该酶酶切后序列;N：5′及N：3′为P：3′及P：5′序列的互补序列。以上基因序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。将合成的各单链稀释成1 nmol/mL，相应的正反两链等体积混合，室温放置2 h后，4 ℃放置30 min，自然退火。文学论文发表

　　1.3.2 pGEX-4T-1-E10-20及pGEX-4T-1-E94-102重组的构建及鉴定

　　将pGEX-4T-1质粒用BamHⅠ和XhoⅠ限制性核酸内切酶酶切回收，经T4DNA连接酶与目的基因连接，转化DH5α/DE3感受态细胞，氨苄青霉素初筛克隆，挑克隆提取质粒DNA，送上海英骏生物技术有限公司测序。文学论文发表

　　1.3.3 E10-20及E94-102 原核小量表达

　　将测序阳性质粒转化BL21/DE3感受态细胞，氨苄青霉素筛选克隆，挑取单菌LB培养基中增菌，37 ℃，250 r/min(r = 12 cm)，培养18 h。取50 ?滋L增菌液接种至5 mL LB培养基中，当吸光度在0.5时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/mL，37 ℃，250 r/min，诱导表达5 h，15% SDS-PAGE分析表达蛋白。

　　1.3.4 E10-20及E94-102 原核大量表达与纯化

　　依小量表达条件进行大量表达，离心收集菌液，加入裂解缓冲液适量，超声破菌，离心取上清液，0.45 μL滤膜过滤，将样品加入平衡好的GST结合树脂中，亲和层析法纯化蛋白，收集洗脱液，用4 × SDS-PAGE上样缓冲液处理样品，行15%SDS-PAGE分析纯化蛋白。文学论文发表

　　1.3.5 免疫血清的获取

　　依文献所述方法[9]纯化CsLDH蛋白，用Bradford[10]测定E10-20、E94-102和CsLDH蛋白浓度，免疫SD大鼠，皮下注射，0.2 mg 第1周，初次免疫;0.1 mg 第2周和第3周，加强免疫，制备抗血清，对各抗体进行初步纯化，间接ELISA法测定各自抗体滴度。

　　1.3.6 CsLDH抗血清对E10-20及E94-102的识别;E10-20及E94-102抗血清对CsLDH的识别

　　均采用Western blotting法和间接ELISA测定，一抗为各抗血清(Western blotting和间接ELISA浓度为别为：1：100和1：50)，二抗为HRP标记的抗大鼠抗体(两方法所用浓度分别为：1：2 000和1：20 000)。文学论文发表

　　1.3.7 CsLDH、E10-20及E94-102免疫血清对重组CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸酶活性的影响

　　重组蛋白酶活性测定参照文献方法[11]。CsLDH催化丙酮酸还原为乳酸的标准反应体系为：10 mmol/L丙酮酸、0.5 mmol/L NADH和100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)。将免疫血清CsLDH、E10-20、E94-102、GST免疫鼠血清以及阴性大鼠血清与CsLDH分别以4：1、2：1、1：1、1：2、1：4、1：8、1：16比例混合，37 ℃水浴中孵育1 h，冰浴终止反应。分光光度法测定340 nm处吸光度的变化，实验至少重复3次，统计学软件分析试验结果。文学论文发表

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒的鉴定和纯化

　　挑取阳性菌，提取质粒，送测序，证实重组质粒克隆成功。将重组质粒转染BL21/DE3感受态细胞，诱导表达SDS-PAGE分析显示在分子质量25.0 ～ 35.0 ku处均出现一条明显条带。pGEX-4T-1本身表达GST为26.0 ku，BamHⅠ与XhoⅠ之间的氨基酸的大小与接入的E10-20和E94-102的分子质量大小均约为2.0 ku，而GST末端被E10-20和E94-102片段所替代，而替代的片段分子质量预测为3.24 ku，所以融合后表达的蛋白比GST本身的分子质量略小，纯化蛋白如第6、10泳道所示(图1)。文学论文发表

　　2.2 Western blotting反应性鉴定

　　Western blotting鉴定结果显示，CsLDH抗血清既能识别E10-20蛋白，也能识别E94-102蛋白，而GST蛋白不能被识别。第5泳道和第6泳道显示CsLDH免疫血清与E94-102蛋白反应更为明显(图2)。表位抗血清对CsLDH蛋白的识别结果显示，E10-20及E94-102抗血清均能识别CsLDH蛋白，而E10-20抗血清更易识别该蛋白(图3)。文学论文发表

　　2.3 ELISA免疫反应性鉴定

　　ELISA结果显示，CsLDH免疫血清能特异性识别E10-20和E94-102中的表位序列，且CsLDH免疫血清对E94-102中表位的识别能力要强于对E10-20中表位的识别。同样，E10-20与E94-102血清中的表位抗体能识别CsLDH蛋白(图4、5)。文学论文发表

　　2.4 CsLDH、E10-20和E94-102免疫血清对重组CsLDH催化丙酮酸还原成乳酸的作用

　　经初步纯化的CsLDH大鼠免疫血清以PBS倍比稀释，在稀释度为1：2 560～1：2时对CsLDH催化的丙酮酸还原成乳酸酶活性的抑制率保持在80% ～ 60%范围当内;在增加血清的体积时，其酶的活性直线下降，至2倍体积时，酶活性抑制基本达100%;阴性对照组，对酶活性基本无明显抑制作用(图6)。

　　经初步纯化的E10-20、E94-102免疫鼠血清，与CsLDH大鼠免疫血清作相同比例稀释，结果显示E94-102免疫鼠血清在1：16 ～ 4：1之间酶活性成梯度下降，在4倍体积于CsLDH时，酶活性抑制达到80%，再增加血清量，抑制率不再增加，E10-20免疫鼠血清则对CsLDH酶活性没有明显的抑制作用(图7)。文学论文发表

　　3 讨 论

　　E10-20和E94-102两个表位氨基酸序列长分别为11 aa和9 aa，在三维空间中均表现为CsLDH分子表面的线性结构[4]。pGEX-4T-1载体表达的GST其末端为游离线性末端。本实验研究将E10-20和E94-102克隆入pGEX-4T-1载体，在目的基因序列后加入TAA终止密码子，连接在GST下游末端，实现各表位与GST的融合表达。文学论文发表

　　CsLDH抗血清对E10-20及E94-102的识别，E10-20及E94-102抗血清对CsLDH的识别，Western blotting和ELISA实验结果的一致性表明此两种表位均为CsLDH线性结构。纯化的CsLDH抗血清当中存在针对这两个表位的特异性抗体成分，而针对E10-20表位所产生的特异性抗体对CsLDH有更强识别能力。E10-20及E94-102免疫大鼠血清中所产生的针对E10-20的特异性抗体和E94-102特异性抗体均能识别CsLDH，且E10-20的特异性抗体更易于识别CsLDH。分析其原因主要是E10-20中实际是含有两个强亲水性表位，两个线性表位与CsLDH本体反应比单一线性表位与本体反应要强。CsLDH的免疫血清中的特异性抗体通过与CsLDH表面的线性表位结合，影响CsLDH的催化功能。以来自于CsLDH的特异性表位E94-102的免疫血清进一步证实了上述结果的推测。Arg102 是酶活性中心的关键氨基酸，特异性抗体与酶活性中心的位点结合，Arg102不能正常行使在酶促反应中的功能，从而影响了整个酶的活性，在宏观上表现为酶促反应受到明显的抑制作用。CsLDH的表位抗体能识别天然的CsLDH，血清活性抑制实验结果均提示我们对于94 ～ 102 aa序列的研究有利于疫苗和新药的设计和研究。文学论文发表

【参考文献】
  　Zhou Z， Huang Y， Hu H， et al. Molecular cloning and identification of a novel Clonorchis sinensis gene encoding a tegumental protein [J]. Parasitol Res， 2007， 101(3)： 737-742.

　　Zhou Z， Xia H， Hu X， et al. Immunogenicity of recombinant Bacillus subtilis spores expressing Clonorchis sinensis tegumental protein[J]. Parasitol Res， 2008， 102(2)： 293-297.

　　Zhou Z， Xia H， Huang Y， et al. Oral administration of a Bacillus subtilis spore-based vaccine expressing Clonorchis sinensis tegumental protein 22.3 kDa confers protection against Clonorchis sinensis[J]. Vaccine， 2008， 26(15)：1817-1825.

　　胡旭初，徐 劲，吕 刚，等. 华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)基因的识别及其结构与功能分析 [J]. 热带医学杂志，2007，7(12)：1145-1148.

　　黄 灿，胡旭初，余新炳，等. 华支睾吸虫乳酸脱氢酶(CsLDH)亚细胞及虫体组织定位 [J]. 中国人兽共患病杂志，2008，24(10)：941-944.

　　杨 凡，刘朝奇，柳发勇，等. HIV-1 gp160多表位嵌-基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析 [J]. 实用医学进修杂志，2008，36(1)：98-102.

　　An LL， Sette A. The multivalent minigene approach to vaccine development[J]. Expert Opin Investig Drugs， 1999， 8(9)： 1351-1357.

　　王艳华，张德林，殷 宏，等. 抗原表位预测方法的研究进展 [J]. 中国兽医科学，2009，39(10)：938-940.

　　Yang G， Jing CX， Zhu PX， et al. Molecular cloning and characterization of a novel lactate dehydrogenase gene from Clonorchis sinensis [J]. Parasitol Res， 2006， 99(1)： 55-64.

　　Bradford MM. A Rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein dye binding [J]. Analyt Biochem， 1976， 72： 248-254.

　　Caroline D， Eric RS， Lucy AH， et al. The kinetic properties and sensitivities to inhibitors of lactate dehydrogenases (LDH1 and LDH2) from Toxoplasma gondii： comparisons with pLDH from Plasmodium falciparum [J]. Mol and Bio Parasitol， 2001， 118(1)： 23-32.文学论文发表