免疫正常Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病的观察

             作者：黄怀球 张静， 薛汝增 张晓辉 冯佩英 李美荣 席丽艳

【摘要】  【目的】 观察免疫正常Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病的发病过程，探讨其模型建立的可行性及实验条件。【方法】 将Wistar大鼠分为实验组(60只)和对照组(6只)，在每只实验组Wistar大鼠背部皮肤选取两个接种部位：右背部及尾根部;制作申克孢子丝菌株SUMS0382的孢子悬液，并调整菌悬液浓度至孢子数为1 × 108 /mL;在实验组Wistar大鼠的每个选取部位皮下注射孢子悬液0.1 mL，造成实验性感染;对照组相应部位则注射8.5 g/L NaCl溶液0.1 mL。接种后12周内每日观察大鼠活力、体质量、皮损数量及直径，并于第2周、4周、8周分别取皮损组织行真菌培养及组织病理。【结果】 皮损在感染后第6天时开始出现，皮损数量及大小均在感染后第2周末达高峰。感染1周后，33%(20/60)的大鼠于接种部位出现皮损，感染2周后，90%(54/60)的大鼠于接种部位出现皮损，尾根部的皮损数目远大于右背部皮损数目。91%(49/54)大鼠的皮损表现为结节。19%(10/54)大鼠的皮损呈现反复的过程。皮损组织真菌培养及组织病理均符合皮肤型孢子丝菌病的改变。【结论】 免疫正常Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病的发病过程反映了人类发病的自然病程，免疫正常Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病模型的建立是可行的。 农业论文发表

【关键词】  孢子丝菌病，皮肤型; Wistar大鼠; 免疫正常; 申克孢子丝菌

　Abstract： 【Objective】 To observe the development of cutaneous sporotrichosis in immunocompetent Wistar rat and investigate the feasibility and experimental conditions for its animal model establishment. 【Methods】 Sixty Wistar rats were inoculated with 0.1 mL of a suspension of 1 × 108 cfu/mL conidial inoculum from the Sporothrix schenckii strain SUMS0382 by subcutaneous route at two site： the right back and the root of tail. The control group was inoculated with 0.1 mL of 0.85% saline. Then activity， weight， number， and diameters of lesions of animals were observed daily for twelve weeks. Fungal culture and histopathology examination of tissue of lesions were conducted at the 4th week， 8th week， and 12th week after inoculation. 【Results】 Lesions were observed at the 6th day post-inoculation and reached to the peak at the end of the 2nd week. 33% of rats and 90% of rats were observed lesions at the inoculation site at the 1st week and 2nd week， respectively. Lesions of rats were mainly (91%) nodules and some of (19%) rats showed repeat courses. Fungal culture and histopathology examination of tissue of lesion confirmed the disease as cutaneous sporotrichosis. 【Conclusions】 Natural course of human cutaneous sporotrichosis was reflected in the Wistar rat and the establishment for immunocompetent Wistar rat model of cutaneous sporotrichosis was feasible.农业论文发表

　　孢子丝菌病是由申克孢子丝菌引起的皮肤、皮下组织及其附近淋巴系统亚急性或慢性感染，在极少数免疫力低下的人群可引起系统播散。在免疫力正常的人群中，皮肤型孢子丝菌病是最常见的感染类型，其病程长，治疗费用昂贵，皮疹常发生在身体暴露部位，严重影响患者的美观和社会生活[1]。国内外学者通过不同方法造成免疫抑制实验动物的系统型孢子丝菌病[2-5]，以研究申克孢子丝菌菌株的毒力差异和系统型孢子丝菌病的致病机理，而关于最常见的皮肤型孢子丝菌病的动物研究少见。本研究首次利用免疫力正常的Wistar大鼠观察研究了皮肤型孢子丝菌病的发病过程，证实了建立免疫正常动物皮肤型孢子丝菌病模型的可行性，为进一步研究皮肤型孢子丝菌病的发病机理提供了基础。农业论文发表

　　1 材料与方法

　　1.1 实验菌株及菌悬液制备

　　经过形态学和分子生物学鉴定的申克孢子丝菌临床分离株SUMS0382(GenBank登录号：FJ011549)分离自一皮肤淋巴管型孢子丝菌病人。参考以往文献[6]，用血球计数板调整菌悬液浓度至孢子数为1 × 108 /mL，内含少量菌丝不计数。农业论文发表

　　1.2 实验动物及分组

　　SPF级Wistar 大鼠66只，雌雄各半，体质量90 ～ 100 g，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK粤2006-0015。将大鼠分为实验组(60只)和对照组(6只)，每组大鼠雌雄各半。农业论文发表

　　1.3 实验性感染

　　采用化学脱毛法将大鼠背部约3 cm × 3 cm区域脱毛。100 g/L水合氯醛按体质量3.0 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，选定2个接种部位，分别为：尾根部、右背部，依次用字母A、B代替;采用皮下注射法，用1 mL注射器在实验组接种部位分别注射孢子丝菌悬液0.1 mL，约含1 × 107个孢子。对照组各接种部位分别注射8.5 g/L NaCl溶液。农业论文发表

　　1.4 检测指标

　　自接种之日起，每日观察大鼠的活力、体质量，皮损的性质(红斑、丘疹、鳞屑、结节、溃疡、结痂)、数量及大小，观察时间为12周。接种后第2周、4周、8周各取2只发病大鼠及1只对照大鼠，切取A、B部位的皮损或正常组织，每个皮损分为两部分。一部分用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡切片，分别行HE和PAS染色，观察皮损的组织病理变化; 另一部分在无菌条件下将剪碎组织，接种于沙氏培养基(sabouraud dextrose agar，SDA)置25 ℃培养。实验结束时，将所有大鼠处死，取出心脏、肝脏及肾脏组织进行真菌培养，检测是否有系统感染。

　　1.5 统计分析

　　使用统计软件SPSS 16.0，对所获数据进行配对的两组二分类资料χ2检验，P < 0.05表示具有统计学意义。农业论文发表

　　2 结 果

　　2.1 一般情况

　　和对照组大鼠相比，所有实验组大鼠接种菌悬液后进食、活动及体质量增长均无异常。

　　2.2 发病情况

　　注射菌液组大鼠皮损在感染后第6天时开始出现，皮损数量及大小均在感染后第2周末达高峰(图1和图2)。感染1周后，33%(20/60)的大鼠于接种部位出现皮损，其中23%(14/60)只在A部位出现皮损，2%(1/60)只在B部位出现皮损，8%(5/60)在A、B部位均出现皮损，在A部位和B部位接种菌悬液造模差异有统计学意义(P = 0.001);感染2周后，90%(54/60)的大鼠于接种部位出现皮损，其中63%(38/60)只在A部位出现皮损，10%(6/60)只在B部位出现皮损，17%(10/60)在A、B部位均出现皮损，再次证实在A部位和B部位接种菌悬液造模差异有统计学意义(P < 0.001)。19%(10/54)大鼠的皮损呈现反复的过程，皮损于出现后第3天开始变小消失，1周后复出现。91%(49/54)大鼠的皮损表现为结节，9%(5/54)大鼠的皮损可由结节破溃成为溃疡或初起为溃疡，之后结痂愈合(图3)。对照组大鼠接种部位无皮损长出。农业论文发表

　　2.3 皮损组织真菌培养

　　感染后第2周、4周、8周切取的皮损组织均可培养出申克孢子丝菌。对照组大鼠接种部位组织真菌培养阴性。

　　2.4 组织病理

　　HE染色显示感染后第2周、4周、8周切取的皮损组织均具有感染性肉芽肿，并具有典型的3层结构，中央是以嗜中性粒细胞为主的“化脓层”，中间层是上皮样细胞或多核巨细胞为主的“结核样层”，最外层是淋巴细胞及浆细胞为主的“梅毒样层”(图4)。PAS染色显示感染后第2周、第4周的皮损组织均可见大量圆形、卵圆形孢子，第8周时孢子数较前减少(图5)。接种部位A和B的皮损组织病理特点相同。对照组大鼠接种部位组织病理未显示异常的病理改变。农业论文发表

　　2.5 系统感染

　　心脏、肝脏及肾脏组织真菌培养均为阴性，说明未有大鼠发生系统播散感染。

　　3 讨 论

　　Wistar大鼠寿命长(2.5 ～ 3年)，对传染病的抵抗力较强，其生理特性和遗传特性较为稳定，对实验条件的反应也较为一致，是研究慢性真菌性疾病的良好工具。本研究首次使免疫力正常的Wistar大鼠感染了皮肤型孢子丝菌病，探讨了建立免疫力正常的Wistar大鼠皮肤型孢子丝菌病模型的条件。农业论文发表

　　皮肤型孢子丝菌病的皮损可表现为结节和溃疡，可自愈、经久不愈或愈后复发[7]。在本研究中，Wistar大鼠被实验性感染申克孢子丝菌后，91%发病大鼠皮损表现为结节，9%发病大鼠的表现为溃疡;19%发病大鼠的皮损反复发作，此现象与人类皮肤型孢子丝菌病的自然病程极其相似。以往利用动物研究皮肤型孢子丝菌病文献中，未有关于此现象的报道[8]。农业论文发表

　　本研究选择Wistar大鼠的右侧背部及尾根部两个不对称的部位进行接种菌液，发现尾根部出现皮损的大鼠数目远高于右背部出现皮损的大鼠数目，与选择动物的对称部位或单一部位进行接种的研究结果[8]有所不同。这一差异是否与两个接种部位的免疫强度不同有关有待进一步研究。农业论文发表

　　本研究发现皮损在感染后第1周开始出现，皮损数量及大小在第2周达高峰，在第5周开始形成瘢痕，与Nobre等[9]观察到的发病过程较为一致。与万力等[8]利用免疫抑制昆明小鼠研究皮肤型孢子丝菌病时发现的皮损出现时间不一致，免疫抑制状态可能推迟了皮损出现的时间。动物本身的免疫状态是影响感染性疾病动物模型的重要因素，免疫抑制状态不能真实得反映皮肤型孢子丝菌病的自然进程和发病机制，具有一定的局限性。

　　实验动物感染皮肤型孢子丝菌病与否，除与动物的免疫状态相关外，尚与所用申克孢子丝菌菌株的毒力和感染途径相关[10-11]。在12周农业论文发表 观察期结束后，对所有实验大鼠的心脏、肝脏及肾脏组织进行真菌培养均为阴性，说明感染只是局限在皮肤，没有发生系统性播散。这与所用菌株临床上导致皮肤型孢子丝菌病的现象符合。农业论文发表

　　本研究利用免疫力正常Wistar大鼠感染皮肤型孢子丝菌病，系统观察了其反映了人类自然病程的发病过程，为建立一个免疫力正常Wistar大鼠皮肤型孢子菌病模型提供了可靠的证据，同时也为进一步研究皮肤型孢子丝菌病的发病机制和进行药效评价提供了基础。农业论文发表

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