不同浓度游离脂肪酸对大鼠系膜细胞外基质基因表达的影响
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发布者：魏明 卢永申 张俊峰 李盼盼
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时间：2011年1月12日 13:43
【摘要】 目的 探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对大鼠系膜细胞外基质基因表达及合成分泌的影响。方法 以体外培养大鼠系膜细胞为基础，采用逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）技术检测Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤维连接蛋白（FN）、转化生长因子（TGF?β1）mRNA的表达；采用酶联免疫吸附ELISA）试验法检测培养系膜细胞上清液ColⅣ、FN的水平。 结果 25、100、400 μmol/L 软脂酸（PA）刺激组ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA的表达分别为（0.99±0.18、1.24±0.16、1.38±0.21）、（0.91±0.13、1.14±0.12、 1.28±0.11）和（1.21±0.09、1.43±0.07、1.54±0.06），与0 μmol/L对照组比较（0.61±0.17、0.62±0.08、0.81±0.10），差异有统计学意义（均P＜0.01）；25、100、400 μmol/L PA刺激组ColⅣ、FN的分泌分别为（59.97±6.48、67.24±6.86、74.38±7.21）ng/ml和（100.91±7.13、 135.04±8.12、154.18±9.11）ng/ml，与0 μmol/L对照组比较（48.84±6.17、88.68±8.08）ng/ml，差异有统计学意义（均P＜0.01）。结论 FFAs具有促进系膜细胞外基质基因表达和分泌的作用，可能在肾小球硬化病理过程中发挥着重要作用。
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【关键词】 脂肪酸；Ⅳ型胶原；纤维连接蛋白；转化生长因子
分别采用逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）技术和酶联免疫吸附（ELISA）试验法对系膜细胞外基质Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白 (FN)、转化生长因子β1（TGF?β1）mRNA表达和体外培养合成分泌水平进行检测，旨在探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对系膜细胞外基质 ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响以及其在肾小球硬化发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
RPMI?1640培养基及新生小牛血清（FCS）为美国Gibco产品，软脂酸（PA）及小牛血清蛋白（d?BSA）为美国Sigma产品。
1.2 细胞培养
大鼠肾小球系膜（HBZY?1）细胞购于郑州大学生理教研室，用含10％FCS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI?1640培养液制成单个细胞悬液，接种于100 ml培养瓶内。当HBZY?1细胞长至80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取第11～14代HBZY?1细胞用于实验。37℃ 5％CO2 100%湿度条件下培养24 h,使细胞处于对数生长期，换成0.5％ FCS RPMI?1640培养液培养24 h使细胞处于静止期。
1.3 实验分组
吸出孔内培养液，加入PA使终浓度分别为25、100、400 μmol/L d?BSA，实验重复3次。
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1.4 RT?PCR体系
按上述方法分组给药，HBZY?1细胞继续培养72 h，PBS冲洗3次，加入1 ml Trizol RNA提取液，提取细胞总RNA。根据A260/A280值计算总 RNA浓度。ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA的引物序列见表1。引物由上海生物工程公司合成。在25 μl 的反应体系中含引物各10 pmol/L，2.5μl的10×buffer，1 mmol/L dNTP，1μl Taq酶，变性94℃ 1 min，退火57℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸2 min。表1 ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA引物序列（略）
1.5 PCR扩增产物电泳
取扩增产物5 μl加载样缓冲液1 μl，在含有0.5 μg/ml 溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶中电泳，标准物为DL2 000 Marker。通过法国紫外凝胶成像系统分析电泳带灰度。
1.6 ELISA法检测培养上清液ColⅣ、FN含量
将5×104/ml HBZY?1细胞接种于24孔微量板中培养24 h，使细胞处于对数生长期，换成0.5％FCS RPMI?1640培养液培养24 h使细胞处于静止期。加入软脂酸1 ml使终浓度分别为25、100、400 μmol/L d?BSA，继续培养72 h，实验重复3次。
1.7 统计学处理
数据以x±s表示。对于正态分布的变量应用单因素方差分析，偏相关分析用于在其他变量固定的条件下某两个相关变量相关分析的检验；所有统计学处理均使用SPSS10.0软件进行。
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2 结果
2.1 不同浓度PA刺激对HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响
以25、100、400μmol/L PA刺激后，ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量均明显升高，与0 μmol/L对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量间两两比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量呈浓度依赖性升高，见图1和表2。表2 不同浓度 PA对HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响(略)
2.2 不同浓度 PA刺激对HBZY?1细胞ColⅣ、FN分泌水平的影响
以25、100、400 μmol/L PA刺激后，ColⅣ、FN分泌水平均明显升高，与0 mol/L对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ColⅣ、FN 分泌水平间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 PA 促进HBZY?1细胞合成分泌ColⅣ、FN，并具有浓度依赖性。见表3。表3 不同浓度 PA对HBZY?1细胞ColⅣ、FN分泌的影响(略)
3 讨论
细胞外基质（FN、ColⅣ、TGF?β1）是细胞生存的微环境，广泛存在各种细胞表面，是构成基底膜的主要成分。在人体的发育、细胞分化与迁移、信号传导等生理过程和炎症损伤与修复、免疫应答以及肿瘤转移病理过程中具有重要功能和作用〔1〕。长期以来，细胞一直是生物界研究疾病的重点。近年来，细胞外基质在疾病的发生中所起的作用越来越受到重视。FFAs与肾小管间质损伤密切相关，是慢性肾脏疾病的一个进展因素。Kamijo等〔2〕报道FFAs能导致肾小管间质损伤。在肾病综合征不是由于白蛋白而是由于结合了 FFAs的白蛋白引起了肾小管损伤〔3〕。Thomas等〔4〕通过大鼠模型研究发现，白蛋白结合FFAs组在巨噬细胞浸润、细胞凋亡和皮质细胞增殖方面均比白蛋白未结合组显著。
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本研究结果显示，不同浓度 PA刺激HBZY?1细胞后，ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量均明显升高，并呈浓度依赖性。提示PA能促进系膜细胞外基质基因的表达。同时还显示HBZY?1细胞合成分泌ColⅣ、FN水平也显著增加，并呈浓度依赖性，表明PA能促进系膜细胞蛋白质的合成。提示FFAs可能是肾小球硬化的一个诱导因素。
总之，在生理情况下肾小球内细胞外基质的合成和降解保持动态平衡，以维持正常的生理功能。当某些病理因素（糖尿病、肾病等）致FFAs增多，导致细胞外基质合成增加或降解减少，造成细胞外基质成分积聚，使细胞外基质的大量堆积引起肾小球硬化发生、发展。
【参考文献】
1 潘琳，李光伟，郭艳茹，等.细胞外基质纤维连接蛋白和层黏连蛋白在糖尿病大鼠DR微血管病变表达的研究〔J〕.中华糖尿病杂志，2004；12（1）:56?8.
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2 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damage〔J〕.Kindney Int，2002；62（12）:1628?37.
3 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal disease〔J〕. Rinsho Byori，2003；51（2）：219?24.
4 Thomas ME，Harris KP，Walls J,et al.Fatty acid exacerbate tubulointerstitial injury in protein?over?load proteinuria〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2002；283（10）:F640?7.
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分别采用逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR）技术和酶联免疫吸附（ELISA）试验法对系膜细胞外基质Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白 (FN)、转化生长因子β1（TGF?β1）mRNA表达和体外培养合成分泌水平进行检测，旨在探讨不同浓度游离脂肪酸（FFAs）对系膜细胞外基质 ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响以及其在肾小球硬化发病机制中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
RPMI?1640培养基及新生小牛血清（FCS）为美国Gibco产品，软脂酸（PA）及小牛血清蛋白（d?BSA）为美国Sigma产品。
1.2 细胞培养
大鼠肾小球系膜（HBZY?1）细胞购于郑州大学生理教研室，用含10％FCS、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的RPMI?1640培养液制成单个细胞悬液，接种于100 ml培养瓶内。当HBZY?1细胞长至80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，取第11～14代HBZY?1细胞用于实验。37℃ 5％CO2 100%湿度条件下培养24 h,使细胞处于对数生长期，换成0.5％ FCS RPMI?1640培养液培养24 h使细胞处于静止期。
1.3 实验分组
吸出孔内培养液，加入PA使终浓度分别为25、100、400 μmol/L d?BSA，实验重复3次。
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1.4 RT?PCR体系
按上述方法分组给药，HBZY?1细胞继续培养72 h，PBS冲洗3次，加入1 ml Trizol RNA提取液，提取细胞总RNA。根据A260/A280值计算总 RNA浓度。ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA的引物序列见表1。引物由上海生物工程公司合成。在25 μl 的反应体系中含引物各10 pmol/L，2.5μl的10×buffer，1 mmol/L dNTP，1μl Taq酶，变性94℃ 1 min，退火57℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸2 min。表1 ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA引物序列（略）
1.5 PCR扩增产物电泳
取扩增产物5 μl加载样缓冲液1 μl，在含有0.5 μg/ml 溴化乙啶的2％琼脂糖凝胶中电泳，标准物为DL2 000 Marker。通过法国紫外凝胶成像系统分析电泳带灰度。
1.6 ELISA法检测培养上清液ColⅣ、FN含量
将5×104/ml HBZY?1细胞接种于24孔微量板中培养24 h，使细胞处于对数生长期，换成0.5％FCS RPMI?1640培养液培养24 h使细胞处于静止期。加入软脂酸1 ml使终浓度分别为25、100、400 μmol/L d?BSA，继续培养72 h，实验重复3次。
1.7 统计学处理
数据以x±s表示。对于正态分布的变量应用单因素方差分析，偏相关分析用于在其他变量固定的条件下某两个相关变量相关分析的检验；所有统计学处理均使用SPSS10.0软件进行。
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2 结果
2.1 不同浓度PA刺激对HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响
以25、100、400μmol/L PA刺激后，ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量均明显升高，与0 μmol/L对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量间两两比较差异有统计学意义（均P＜0.05）。HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量呈浓度依赖性升高，见图1和表2。表2 不同浓度 PA对HBZY?1细胞ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达的影响(略)
2.2 不同浓度 PA刺激对HBZY?1细胞ColⅣ、FN分泌水平的影响
以25、100、400 μmol/L PA刺激后，ColⅣ、FN分泌水平均明显升高，与0 mol/L对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。ColⅣ、FN 分泌水平间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。 PA 促进HBZY?1细胞合成分泌ColⅣ、FN，并具有浓度依赖性。见表3。表3 不同浓度 PA对HBZY?1细胞ColⅣ、FN分泌的影响(略)
3 讨论
细胞外基质（FN、ColⅣ、TGF?β1）是细胞生存的微环境，广泛存在各种细胞表面，是构成基底膜的主要成分。在人体的发育、细胞分化与迁移、信号传导等生理过程和炎症损伤与修复、免疫应答以及肿瘤转移病理过程中具有重要功能和作用〔1〕。长期以来，细胞一直是生物界研究疾病的重点。近年来，细胞外基质在疾病的发生中所起的作用越来越受到重视。FFAs与肾小管间质损伤密切相关，是慢性肾脏疾病的一个进展因素。Kamijo等〔2〕报道FFAs能导致肾小管间质损伤。在肾病综合征不是由于白蛋白而是由于结合了 FFAs的白蛋白引起了肾小管损伤〔3〕。Thomas等〔4〕通过大鼠模型研究发现，白蛋白结合FFAs组在巨噬细胞浸润、细胞凋亡和皮质细胞增殖方面均比白蛋白未结合组显著。
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本研究结果显示，不同浓度 PA刺激HBZY?1细胞后，ColⅣ、FN、TGF?β1 mRNA表达量均明显升高，并呈浓度依赖性。提示PA能促进系膜细胞外基质基因的表达。同时还显示HBZY?1细胞合成分泌ColⅣ、FN水平也显著增加，并呈浓度依赖性，表明PA能促进系膜细胞蛋白质的合成。提示FFAs可能是肾小球硬化的一个诱导因素。
总之，在生理情况下肾小球内细胞外基质的合成和降解保持动态平衡，以维持正常的生理功能。当某些病理因素（糖尿病、肾病等）致FFAs增多，导致细胞外基质合成增加或降解减少，造成细胞外基质成分积聚，使细胞外基质的大量堆积引起肾小球硬化发生、发展。
【参考文献】
1 潘琳，李光伟，郭艳茹，等.细胞外基质纤维连接蛋白和层黏连蛋白在糖尿病大鼠DR微血管病变表达的研究〔J〕.中华糖尿病杂志，2004；12（1）:56?8.
如何快速发表论文
2 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damage〔J〕.Kindney Int，2002；62（12）:1628?37.
3 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal disease〔J〕. Rinsho Byori，2003；51（2）：219?24.
4 Thomas ME，Harris KP，Walls J,et al.Fatty acid exacerbate tubulointerstitial injury in protein?over?load proteinuria〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2002；283（10）:F640?7.
