Tim4基因定量检测方法的建立及在消化道肿瘤中的初步应用
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时间：2011年3月24日 13:02
【摘要】 目的： 建立T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4(T cells immunoglobulin?and mucin?domain?containing molecule 4，Tim4)基因表达的实时荧光定量PCR(实时RT?PCR)的检测方法，探讨Tim4基因在消化道肿瘤中的表达差异。方法： 构建包含Tim4基因片段的标准质粒，通过RT?PCR，实时RT?PCR等检测并比较Tim4基因在37例胃癌组织、19例结直肠癌组织与对应癌旁组织中的表达水平。 结果： 建立的Tim4基因定量检测方法准确可靠；在37例胃癌组织中，26例癌旁组织Tim4基因表达量高于对应癌组织(26/37)，且在26例癌旁组织高表达的样本中，18例（69.2%）胃癌癌旁组织与癌组织表达比率大于2；在19例结直肠癌中12例癌旁组织表达高于对应的癌组织(12/19)，其中癌旁组织高表达率（大于2）为 75.0%(9/12)。结论： 成功建立了检测Tim4基因的实时RT?PCR方法，Tim4基因在结直肠癌和胃癌的癌组织中表达呈低趋势，这为深入探讨Tim4基因与肿瘤的关系提供了实验基础。
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【关键词】 T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4； 实时荧光定量RT?PCR； 胃癌； 结直肠癌
［Abstract］Objective: To establish a method of real?time RT?PCR for T cells immunoglobulin? and mucin? domain? containing molecule 4(Tim4) and investigate its expression in colorectal cancer and gastric cancer.Methods： The standard plasmid of Tim4 gene was firstly constructed.The levels of expression of Tim4 in the tumor tissues of 37 patients with gastric cancer and 19 patients with colorectal cancer were detected by RT?PCR and real?time PCR. Results： The standard quantitative curve of Tim4 gene was generated(correlation coefficient r=0.998).The real?time RT?PCR for Tim4 was accurate and reliable.The expression of Tim4 gene in the gastric cancer tissues(26/37) was lower than that in the matching adjacent non?cancerous tissues. The rate of higher expression of Tim4 gene(>2) in adjacent non?cancerous tissues/gastric cancer tissues was 69.2%(18/26).Likewise, 12 samples expression of Tim4 gene in the colorectal cancer tissues of 19 patients were lower than that in the matching adjacent non?cancerous tissues, the rate of higher expression of Tim4 gene(>2) in adjacent non?cancerous tissues was 75.0%(9/12). Conclusion： A stable real?time RT?PCR has been successfully established for detection of Tim4 gene expression.Expression of Tim4 gene is lower in gastric cancer and colorectal cancer tissues,and provide a platform for Tim4 and cancer studies.
［Key words］T cells immunoglobulin? and mucin? domain? containing molecule 4； real?time RT?PCR；gastric cancer； colorectal cancer
T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4（T cells immunoglobulin? and mucin?domain? containing molecule 4, Tim4）也称为Timd4，是有调节细胞免疫应答作用的Tim基因家族的成员［1］，主要表达于抗原递呈细胞, 特别是成熟的树突状淋巴细胞，能与Tim1特异性结合而调节T细胞增殖［2］。近年研究显示，Tim4是磷脂酰丝氨酸的受体，能通过磷脂酰丝氨酸与细胞结合而促进凋亡细胞的吞噬作用［3］。由于Tim4与凋亡关系密切，这使我们关注其与干细胞及肿瘤的相关性，为此本研究在建立定量RT?PCR检测Tim4 基因表达的基础上，初步探讨该基因在结直肠癌和胃癌组织中的表达水平，为深入探讨Tim4与肿瘤的相关性提供实验数据。
1 材料和方法
1.1 细胞与患者标本
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人脐带来源的间质干细胞（ucMSC），人胃癌细胞株（SGC?7901）；胃癌标本37例，其中男23例，女14例，年龄44～75岁,中位年龄61岁。结直肠癌标本19例，其中男12例，女7例，年龄 37～84岁,中位年龄63岁。所有病例取自2008年1月至2009年5月江苏大学附属人民医院和江苏大学附属医院外科收治并经病理组织学确诊的手术切除标本，术前均未接受化疗及放疗，所取患者标本皆为成对的癌组织和癌旁组织(距癌变部位边界5 cm以外且经病理证实无癌变的组织)。
1.2 方 法
1.2.1 总RNA提取和逆转录
培养的细胞取107个，组织标本取50 mg研碎，各加Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。提取的总RNA经鉴定后取完整性好的样品，用逆转录试剂盒(MBI)以Oligo(dT)为引物，合成cDNA。
1.2.2 引物设计
参照基因库提供的人Tim4 mRNA（NM_138379）的完整序列设计引物。Tim4, β?肌动蛋白基因的引物皆跨外显子设计，引物序列和PCR扩增产物长度见表1。
1.2.3 RT?PCR
反应体系为10×缓冲液(含Mg2+) 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，10 pmol/μl 的上下游引物各0.5 μl，5 U/μl Taq酶0.2 μl，模板cDNA 1 μl，加ddH2O补足至25 μl 。PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，Tim4(58℃)，β?肌动蛋白(56℃)退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳观察结果。 表1 Tim4, β?肌动蛋白基因引物序列（略）
1.2.4 Tim4 标准质粒制备
从ucMSC细胞中经RT?PCR扩增出Tim4的cDNA片段和β?肌动蛋白的cDNA片段，使用T?A克隆试剂盒，将纯化的PCR产物连接入pMD?18T载体（TaKaRa），转化入DH5α感受态菌，筛选阳性克隆，扩菌后纯化提取质粒，倍比稀释质粒以绘制标准曲线。
1.2.5 定量RT?PCR
反应体系：2×SYBR?Green Real time PCR Master Mix 10 μl，1.0 μl cDNA 模板，引物各 0.5 μl(10 pmol/μl ),用dd H2O 补足至 20 μl 。PCR循环参数：95℃预变性5 min，使用4步法扩增，具体为94℃ 30 s, 58℃(Tim4)/56℃(β?肌动蛋白)30 s, 72℃ 30 s, 85℃(Tim4)/88℃(β?肌动蛋白) 8 s后检测荧光，35个循环。
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1.2.6 统计分析
采用 SPSS 13.0系统软件进行统计分析，配对资料比较采用 Wilcoxon′s signed ? rank tests。
2 结 果
2.1 实时定量PCR扩增Tim4
以107～102拷贝/μl 的标准质粒为模板扩增Tim4基因，标准曲线相关系数为0.99873（图1a）；经融解曲线分析显示，在85℃检测荧光，可排除引物二聚体等的干扰，标准质粒扩增特异（图1b）。以β?肌动蛋白为内参照，同样绘制标准曲线，标准质粒拷贝数为109～104拷贝/μl，相关系数为0.99937（图 1c），88℃检测荧光同样可排除非特异扩增的干扰（图1d）。
2.2 RT?PCR检测Tim4基因的表达
采用RT?PCR方法扩增了细胞和组织标本，结果显示人脐带间质干细胞（ucMSC）与人胃癌细胞（SGC?7901）皆有Tim4 mRNA的表达，但SGC?7901细胞中表达极弱。在37例胃癌成对标本中，癌旁组织和配对胃癌组织皆有扩增，但扩增条带有强弱之分（图2）。19例结直肠癌与配对癌旁组织研究与胃癌中的结果类似（结果未显示）。
2.3 实时定量PCR分析Tim4在胃癌和结直肠癌组织中的表达
在构建的Tim4标准质粒绘制标准曲线基础上，以β?肌动蛋白的表达量为内参照，通过两者的比值分析Tim4基因在癌组织和癌旁组织中的表达差异，结果显示在37例胃癌成对标本中，26例癌旁组织中的Tim4表达高于癌组织，且在26例癌旁组织高表达的样本中，18例（69.2%）胃癌癌旁组织与癌组织表达比率大于2，但差异无统计学意义（图3a）。19例结直肠癌和配对癌旁组织标本中，12例标本癌旁组织的Tim4表达高于癌组织(12/19)，在19 例结直肠癌中12例癌旁组织表达高于对应的癌旁组织，其中癌旁组织表达高于癌组织2倍的有9例（75.0%）, 差异同样无统计学意义（图3b）。
3 讨 论
Tim基因家族是2003年新发现的具有调节Th1，Th2细胞介导免疫应答作用的基因家族［1］。人类Tim基因家族由3个成员组成，即 Tim1，Tim3，Tim4，位于染色体5q33.2。Tim4是Tim1的配体，主要表达于抗原递呈细胞, 特别是成熟的树突状淋巴细胞，涉及Th1?Th2细胞的平衡。Khademi等［4］研究发现，Tim蛋白可能涉及Th1 和Th2细胞介导的疾病，如多发性硬化症等，现主要研究多集中在对Tim多态性与自身免疫性疾病、过敏性疾病（如哮喘）的相关性方面［5,6］。
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鉴于Tim4与细胞凋亡关系密切，本研究首先建立了检测人Tim4基因表达的实时荧光定量PCR的方法，为Tim4基因的定量检测提供可能；初步探讨其在不同肿瘤组织，如胃癌和结直肠癌中的表达水平。研究结果显示，在大多数胃癌和结直肠癌患者中，Tim4在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织，但无论在胃癌还是结直肠癌，癌组织和癌旁组织中的Tim4 mRNA表达水平并无显著的统计学差异，这可能与样本例数较少，肿瘤标本未分期等相关，可进一步扩大标本量，从蛋白水平探讨Tim4在肿瘤中的表达，并对其作用机制进行深入研究。
本研究建立的检测Tim4基因表达的实时定量PCR方法特异性好，敏感性高，线性范围广且结果稳定可靠，可用于其他肿瘤组织或肿瘤患者血清学中Tim4的定量分析。本研究显示Tim4基因在胃癌和结直肠癌的癌组织中均有不同程度表达，肿瘤标本中 Tim4基因表达的定量检测可能提供一些新的实验数据，Tim4与肿瘤的相关性值得探讨。
【参考文献】
［1］Kuchroo VK, Umetsu DT, Dekruyff RH, et al.The TIM gene family: emerging roles in immunity and disease［J］.Nat Rev Immunol, 2003, 3(6):454-462.
［2］Meyers JH, Chakavarti S, Schlesinger D, et al.TIM?4 is the ligand for TIM?1, and the TIM?1?TIM?4 interaction regulates T cell proliferation［J］.Nat Immunol, 2005, 6(5): 455-464.
［3］Miyanishi M, Tada K, Koike M, et al.Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor［J］.Nature, 2007, 450(7168):435-439.
［4］Khademi M, Illes Z, Alexander W, et al.T cell Ig?and mucin?domain?containing molecule?3(TIM?3) and TIM?1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid?derived mononuclear cells in multiple sclerosis［J］.J Immunol, 2004, 172(11): 7169-7176.
［5］Cai PC, Wu QW, Wang L, et al.Distribution characteristics and linkage disequilibrium of TIM4 promoter polymorphisms in asthma patients of Chinese Han population［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2008, 28(4): 447-450.
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［6］夏义平,崔天盆,吴健民.TIM4 基因多态性与湖北汉族变应性哮喘的相关性研究［J］.中华医学遗传学杂志, 2007, 24(2): 213-216.
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【关键词】 T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4； 实时荧光定量RT?PCR； 胃癌； 结直肠癌
［Abstract］Objective: To establish a method of real?time RT?PCR for T cells immunoglobulin? and mucin? domain? containing molecule 4(Tim4) and investigate its expression in colorectal cancer and gastric cancer.Methods： The standard plasmid of Tim4 gene was firstly constructed.The levels of expression of Tim4 in the tumor tissues of 37 patients with gastric cancer and 19 patients with colorectal cancer were detected by RT?PCR and real?time PCR. Results： The standard quantitative curve of Tim4 gene was generated(correlation coefficient r=0.998).The real?time RT?PCR for Tim4 was accurate and reliable.The expression of Tim4 gene in the gastric cancer tissues(26/37) was lower than that in the matching adjacent non?cancerous tissues. The rate of higher expression of Tim4 gene(>2) in adjacent non?cancerous tissues/gastric cancer tissues was 69.2%(18/26).Likewise, 12 samples expression of Tim4 gene in the colorectal cancer tissues of 19 patients were lower than that in the matching adjacent non?cancerous tissues, the rate of higher expression of Tim4 gene(>2) in adjacent non?cancerous tissues was 75.0%(9/12). Conclusion： A stable real?time RT?PCR has been successfully established for detection of Tim4 gene expression.Expression of Tim4 gene is lower in gastric cancer and colorectal cancer tissues,and provide a platform for Tim4 and cancer studies.
［Key words］T cells immunoglobulin? and mucin? domain? containing molecule 4； real?time RT?PCR；gastric cancer； colorectal cancer
T细胞免疫球蛋白及黏蛋白域分子4（T cells immunoglobulin? and mucin?domain? containing molecule 4, Tim4）也称为Timd4，是有调节细胞免疫应答作用的Tim基因家族的成员［1］，主要表达于抗原递呈细胞, 特别是成熟的树突状淋巴细胞，能与Tim1特异性结合而调节T细胞增殖［2］。近年研究显示，Tim4是磷脂酰丝氨酸的受体，能通过磷脂酰丝氨酸与细胞结合而促进凋亡细胞的吞噬作用［3］。由于Tim4与凋亡关系密切，这使我们关注其与干细胞及肿瘤的相关性，为此本研究在建立定量RT?PCR检测Tim4 基因表达的基础上，初步探讨该基因在结直肠癌和胃癌组织中的表达水平，为深入探讨Tim4与肿瘤的相关性提供实验数据。
1 材料和方法
1.1 细胞与患者标本
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人脐带来源的间质干细胞（ucMSC），人胃癌细胞株（SGC?7901）；胃癌标本37例，其中男23例，女14例，年龄44～75岁,中位年龄61岁。结直肠癌标本19例，其中男12例，女7例，年龄 37～84岁,中位年龄63岁。所有病例取自2008年1月至2009年5月江苏大学附属人民医院和江苏大学附属医院外科收治并经病理组织学确诊的手术切除标本，术前均未接受化疗及放疗，所取患者标本皆为成对的癌组织和癌旁组织(距癌变部位边界5 cm以外且经病理证实无癌变的组织)。
1.2 方 法
1.2.1 总RNA提取和逆转录
培养的细胞取107个，组织标本取50 mg研碎，各加Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA。提取的总RNA经鉴定后取完整性好的样品，用逆转录试剂盒(MBI)以Oligo(dT)为引物，合成cDNA。
1.2.2 引物设计
参照基因库提供的人Tim4 mRNA（NM_138379）的完整序列设计引物。Tim4, β?肌动蛋白基因的引物皆跨外显子设计，引物序列和PCR扩增产物长度见表1。
1.2.3 RT?PCR
反应体系为10×缓冲液(含Mg2+) 2.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，10 pmol/μl 的上下游引物各0.5 μl，5 U/μl Taq酶0.2 μl，模板cDNA 1 μl，加ddH2O补足至25 μl 。PCR循环参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，Tim4(58℃)，β?肌动蛋白(56℃)退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃ 10 min。琼脂糖凝胶电泳观察结果。 表1 Tim4, β?肌动蛋白基因引物序列（略）
1.2.4 Tim4 标准质粒制备
从ucMSC细胞中经RT?PCR扩增出Tim4的cDNA片段和β?肌动蛋白的cDNA片段，使用T?A克隆试剂盒，将纯化的PCR产物连接入pMD?18T载体（TaKaRa），转化入DH5α感受态菌，筛选阳性克隆，扩菌后纯化提取质粒，倍比稀释质粒以绘制标准曲线。
1.2.5 定量RT?PCR
反应体系：2×SYBR?Green Real time PCR Master Mix 10 μl，1.0 μl cDNA 模板，引物各 0.5 μl(10 pmol/μl ),用dd H2O 补足至 20 μl 。PCR循环参数：95℃预变性5 min，使用4步法扩增，具体为94℃ 30 s, 58℃(Tim4)/56℃(β?肌动蛋白)30 s, 72℃ 30 s, 85℃(Tim4)/88℃(β?肌动蛋白) 8 s后检测荧光，35个循环。
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1.2.6 统计分析
采用 SPSS 13.0系统软件进行统计分析，配对资料比较采用 Wilcoxon′s signed ? rank tests。
2 结 果
2.1 实时定量PCR扩增Tim4
以107～102拷贝/μl 的标准质粒为模板扩增Tim4基因，标准曲线相关系数为0.99873（图1a）；经融解曲线分析显示，在85℃检测荧光，可排除引物二聚体等的干扰，标准质粒扩增特异（图1b）。以β?肌动蛋白为内参照，同样绘制标准曲线，标准质粒拷贝数为109～104拷贝/μl，相关系数为0.99937（图 1c），88℃检测荧光同样可排除非特异扩增的干扰（图1d）。
2.2 RT?PCR检测Tim4基因的表达
采用RT?PCR方法扩增了细胞和组织标本，结果显示人脐带间质干细胞（ucMSC）与人胃癌细胞（SGC?7901）皆有Tim4 mRNA的表达，但SGC?7901细胞中表达极弱。在37例胃癌成对标本中，癌旁组织和配对胃癌组织皆有扩增，但扩增条带有强弱之分（图2）。19例结直肠癌与配对癌旁组织研究与胃癌中的结果类似（结果未显示）。
2.3 实时定量PCR分析Tim4在胃癌和结直肠癌组织中的表达
在构建的Tim4标准质粒绘制标准曲线基础上，以β?肌动蛋白的表达量为内参照，通过两者的比值分析Tim4基因在癌组织和癌旁组织中的表达差异，结果显示在37例胃癌成对标本中，26例癌旁组织中的Tim4表达高于癌组织，且在26例癌旁组织高表达的样本中，18例（69.2%）胃癌癌旁组织与癌组织表达比率大于2，但差异无统计学意义（图3a）。19例结直肠癌和配对癌旁组织标本中，12例标本癌旁组织的Tim4表达高于癌组织(12/19)，在19 例结直肠癌中12例癌旁组织表达高于对应的癌旁组织，其中癌旁组织表达高于癌组织2倍的有9例（75.0%）, 差异同样无统计学意义（图3b）。
3 讨 论
Tim基因家族是2003年新发现的具有调节Th1，Th2细胞介导免疫应答作用的基因家族［1］。人类Tim基因家族由3个成员组成，即 Tim1，Tim3，Tim4，位于染色体5q33.2。Tim4是Tim1的配体，主要表达于抗原递呈细胞, 特别是成熟的树突状淋巴细胞，涉及Th1?Th2细胞的平衡。Khademi等［4］研究发现，Tim蛋白可能涉及Th1 和Th2细胞介导的疾病，如多发性硬化症等，现主要研究多集中在对Tim多态性与自身免疫性疾病、过敏性疾病（如哮喘）的相关性方面［5,6］。
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鉴于Tim4与细胞凋亡关系密切，本研究首先建立了检测人Tim4基因表达的实时荧光定量PCR的方法，为Tim4基因的定量检测提供可能；初步探讨其在不同肿瘤组织，如胃癌和结直肠癌中的表达水平。研究结果显示，在大多数胃癌和结直肠癌患者中，Tim4在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织，但无论在胃癌还是结直肠癌，癌组织和癌旁组织中的Tim4 mRNA表达水平并无显著的统计学差异，这可能与样本例数较少，肿瘤标本未分期等相关，可进一步扩大标本量，从蛋白水平探讨Tim4在肿瘤中的表达，并对其作用机制进行深入研究。
本研究建立的检测Tim4基因表达的实时定量PCR方法特异性好，敏感性高，线性范围广且结果稳定可靠，可用于其他肿瘤组织或肿瘤患者血清学中Tim4的定量分析。本研究显示Tim4基因在胃癌和结直肠癌的癌组织中均有不同程度表达，肿瘤标本中 Tim4基因表达的定量检测可能提供一些新的实验数据，Tim4与肿瘤的相关性值得探讨。
【参考文献】
［1］Kuchroo VK, Umetsu DT, Dekruyff RH, et al.The TIM gene family: emerging roles in immunity and disease［J］.Nat Rev Immunol, 2003, 3(6):454-462.
［2］Meyers JH, Chakavarti S, Schlesinger D, et al.TIM?4 is the ligand for TIM?1, and the TIM?1?TIM?4 interaction regulates T cell proliferation［J］.Nat Immunol, 2005, 6(5): 455-464.
［3］Miyanishi M, Tada K, Koike M, et al.Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor［J］.Nature, 2007, 450(7168):435-439.
［4］Khademi M, Illes Z, Alexander W, et al.T cell Ig?and mucin?domain?containing molecule?3(TIM?3) and TIM?1 molecules are differentially expressed on human Th1 and Th2 cells and in cerebrospinal fluid?derived mononuclear cells in multiple sclerosis［J］.J Immunol, 2004, 172(11): 7169-7176.
［5］Cai PC, Wu QW, Wang L, et al.Distribution characteristics and linkage disequilibrium of TIM4 promoter polymorphisms in asthma patients of Chinese Han population［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci, 2008, 28(4): 447-450.
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［6］夏义平,崔天盆,吴健民.TIM4 基因多态性与湖北汉族变应性哮喘的相关性研究［J］.中华医学遗传学杂志, 2007, 24(2): 213-216.
