结核分枝杆菌ESAT-6诊断抗原基因的克隆及同源性分析
热度0票 浏览143次
时间：2011年3月15日 14:09
【摘要】 目的 获得结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因，进行DNA测序、同源性分析，为筛选结核病候选诊断抗原基因奠定基础。 方法 以结核菌标准菌株H37Rv为模板，通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因，将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和生物信息学分析。 结果 成功扩增出结核分枝杆菌ESAT-6抗原基因，测序表明该片段开放阅读框由288bp组成，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为99%，推导编码氨基酸序列同源性为90%。 结论 成功克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因，测序结果表明该片段阅读框完整。
如何快速发表论文
【关键词】 结核分枝杆菌；ESAT-6基因；克隆；序列分析
Abstract: Objective To obtain and analyze characters and homologies of ESAT-6 gene sequence, and lay bases for screening candidate antigen of Mycobacterium tuberculosis. Methods Total RNA was extracted from protoscoles of cysts. The ESAT-6 gene of Mycobacterium tuberculosis was amplified by PCR and recombined into pGEM-T vector for sequencing and analyzing. Results A DNA sequence with an open reading frame of 288bp had been amplified successfully by PCR . Compared with the DNA sequence published , the homologies were 99% , which deduced that the amino acid sequence of ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis were 90％ identities. Conclusion ESAT-6 gene was cloned successfully. By analyzing the DNA sequence , we can make sure that the segment of amplification is ESAT-6 , and its reading frame is integrity.
Key words: mycobacterium tuberculosis; ESAT-6 gene;cloning;sequencing
结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。但现有的结核病诊断方法多不能达到早期、有效、特异的诊断目的，如细菌学检查虽然是结核病确诊的金标准，但常见阴性结果［1］。痰涂片检出率太低，MTB培养繁琐费时；影像学和临床症状检查很难做到早期发现和大规模普查；免疫学诊断虽因简单、快速、灵敏有较好的发展前景，但缺乏特异性抗原。对于MTB潜伏感染者的筛查，由于结核菌素纯蛋白衍生物(protein purified derivative,PPD)包含的抗原成分复杂，因而特异性差、实验灵敏度不够。因此，寻找结核特异性抗原对结核病诊断至关重要。本研究拟通过分子生物学技术手段获得结核分枝杆菌ESAT-6（6KDa Early Secretory Antigenic Target)基因，并进行序列测定及同源性分析，为其进一步原核表达及相关研究奠定基础。
1 材料与方法如何快速发表论文
1．1 材料
1.1.1 质粒与菌种
标准菌株H37RvDNA由西安第四军医大学王丽梅博士友情馈赠，pGEM-T 连接载体购自Promega 公司。
1.1.2 酶与试剂
E.coli JM109感受态购自北京全式金生物技术公司，X-gal、IPTG、TaqDNA聚合酶购自Promega 公司，限制性内切酶EcoRI、XholI购自HIMERx公司，200bpDNA Marker、λDNA HindⅢ Marker购自北京华美公司，质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生物工程公司。
1.1.3 PCR引物
通过互联网GeneBank 公共数据库检索出结核分枝杆菌ESAT-6基因序列（GenBank序列号：AY208674），分别在起始端和末端设计出一对引物。
P1: 5'-CTGAATTCATGACAGAGCAGCAGTGG-3'
P2: 5'-GTCTCGAGCTATGCGAACATCCCCGC-3'
为了便于亚克隆，在引物1和引物2的两端分别引入了一个EcoRI和XholI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。
1．2 方法如何快速发表论文
1.2.1 聚合酶链反应（PCR）
反应组成为：10×Buffer（含Mg2+）2.5μL, 10mmol dNTP 0.5μL,引物1和引物2各0.5μL，DNA 2μL，TaqDNA酶0.5μL，ddH2O 18.5μL。反应条件为：94℃ 4min; 94℃ 30s, 60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。待反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。
1.2.2 PCR产物的纯化与目的基因的克隆
用DNA回收试剂盒对PCR产物切胶回收。DNA与pGEM-T载体在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，将其涂布于预先铺有(1M)IPTG和X-gal的YT平板上37℃培养过夜。
1.2.3 重组质粒的酶切鉴定
经蓝白斑筛选，挑选白色菌落 ，碱裂解法提取质粒，用EcoRI、XholI酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 DNA序列测定及特性分析
扩增片段重组质粒的序列由上海生物工程公司进行。将测序结果在NCBI/GeneBank数据库进行BLAST比较和分析。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌ESAT-6目的基因的扩增
PCR成功扩增出特异性DNA片段，位于300bp左右，与预期结果一致，见图1。
2.2 ESAT-6/ pGEM-T/JM109重组质粒的构建及鉴定
PCR产物与pGEM-T载体连接，构建了扩增片段/ pGEM-T/JM109重组克隆体系。经酶切鉴定，得到了大约300bp的DNA片段，见图2。
2.3 ESAT-6基因测序结果及同源性比对分析
从正反两个方向对插入片段进行测序，双向测序的结果相吻合。测序结果显示ESAT-6目的片段完整开放阅读框由288bp组成。将序列与GenBank中已发表的基因（GenBank序列号：NC_010612.1）核酸序列进行比较，结果发现有2处2个碱基有所不同，同源性达99%（图3）。与 GenBank中已发表的基因（GenBank序列号：pdb|1WA8|B）氨基酸序列进行比较，同源性达90%（图4）。Query：ESAT-6基因序列 Sbjct：GenBank已发表序列
3 讨论
ESAT-6蛋白是一种MTB早期分泌蛋白，由RD1区基因Rv3875编码。通过对MTB 的早期培养滤液( STCF)和不同组分进行分析［2］，发现ESAT-6蛋白不仅存在于STCF，还存在于细胞浆和细胞壁中。Brondt等［3］发现ESAT-6蛋白可刺激结核菌感染小鼠的淋巴细胞增殖，并诱导模型小鼠的淋巴细胞有效释放IFNγ。Martin［4］的研究证明Query：ESAT-6基因序列 Sbjct：GenBank已发表序列ESAT-6蛋白可诱导结核菌感染豚鼠产生迟发型超敏反应。Pathan等［5］选用不同程度的MTB感染者为实验对象，用ESAT-6 ELISPOT方法计数外周血中分泌IFNγ的T细胞，结果发现除了未感染过MTB的人群呈阴性反应，其余各组包括TST阳性的结核病密切接触者、淋巴结核患者、痰菌阴性的肺结核患者和痰菌阳性的肺结核患者均呈阳性反应。Lalvani［6-7］研究结果也证实了ESAT-6 ELISPOT 诊断活动性结核病比PPD ELISPOT 和TST的敏感性和特异性均高，且对CPTB、弥散性结核、肺外结核以及伴有HIV阳性的结核病均有很好的诊断效果。ESAT-6蛋白的分布特异性和良好免疫原性决定其可能作为特异性抗原用于结核病诊断。
本研究通过Internet检索到GeneBank 发表的结核分支杆菌ESAT-6序列，应用PCR方法扩增出一个288bp的基因片段，同时在PCR引物设计时，分别在上、下游引物中的5’端加入了两个酶切位点来保证定向克隆；将PCR产物重组于克隆载体pGEM-T。这一过程既能保证在DNA测序时的准确性，也能保证在进一步的亚克隆到表达载体前提高双酶切的效率，同时还可长期保存和反复利用目的基因。经NCBI/BLAST分析，本研究克隆基因与GeneBank报道基因序列有99%同源性，预测为 95个氨基酸组成的ESAT-6肽链。该基因片段的获得为下一步蛋白表达、纯化及血清学诊断价值的研究工作奠定基础。
如何快速发表论文
【参考文献】
［1］Katoch VM. Newerdiagnostic techniques for tuberculosis［J］. Indian J Med Res, 2004, 120 (4): 418-428.
［2］AL Sorensen, S Nagai, G Houen, et al. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis ［J］.Infect Immun,1995, 63: 1710-1717.
［3］Brondt L, Oettinger T, Holm A, et al. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis ［J］. J Immunol, 1996, 157: 3527-3533.
［4］Martin JE, Oettinger T, Andersen P. Delayed-Type Hypersensitivity Responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the Guinea Pig ［J］. Infect Immun, 1998, 66: 3454-3456.
［5］Pathan AA, Wilkinson KA, Klenerman P, et al. Direct Ex Vivo Analysis of Antigen-Specific IFN-Secreting CD4 T Cells in Mycobacterium tuberculosis-Infected Individuals: Associations with Clinical Disease State and Effect of Treatment［J］. J Immunol, 2001, 167:5217-5225.
［6］LalvaniA, Nagvenkar P, Udwadia Z, et al. Enumeration of T cells specific for RD1-encoded antigens suggests a high prevalence of latent Mycobacterium tuberculosis infection in healthy urban Indians［J］.J Infect Dis, 2001, 183: 469-477.
如何快速发表论文
［7］Lalvani A, Pathan A, Mcshane H, et al. Pulmonary function tuberculosis and pulmonary vascular disease: Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection by Enumeration of Antigen-specific T Cells［J］. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163: 824-828.
如何快速发表论文
【关键词】 结核分枝杆菌；ESAT-6基因；克隆；序列分析
Abstract: Objective To obtain and analyze characters and homologies of ESAT-6 gene sequence, and lay bases for screening candidate antigen of Mycobacterium tuberculosis. Methods Total RNA was extracted from protoscoles of cysts. The ESAT-6 gene of Mycobacterium tuberculosis was amplified by PCR and recombined into pGEM-T vector for sequencing and analyzing. Results A DNA sequence with an open reading frame of 288bp had been amplified successfully by PCR . Compared with the DNA sequence published , the homologies were 99% , which deduced that the amino acid sequence of ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis were 90％ identities. Conclusion ESAT-6 gene was cloned successfully. By analyzing the DNA sequence , we can make sure that the segment of amplification is ESAT-6 , and its reading frame is integrity.
Key words: mycobacterium tuberculosis; ESAT-6 gene;cloning;sequencing
结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。但现有的结核病诊断方法多不能达到早期、有效、特异的诊断目的，如细菌学检查虽然是结核病确诊的金标准，但常见阴性结果［1］。痰涂片检出率太低，MTB培养繁琐费时；影像学和临床症状检查很难做到早期发现和大规模普查；免疫学诊断虽因简单、快速、灵敏有较好的发展前景，但缺乏特异性抗原。对于MTB潜伏感染者的筛查，由于结核菌素纯蛋白衍生物(protein purified derivative,PPD)包含的抗原成分复杂，因而特异性差、实验灵敏度不够。因此，寻找结核特异性抗原对结核病诊断至关重要。本研究拟通过分子生物学技术手段获得结核分枝杆菌ESAT-6（6KDa Early Secretory Antigenic Target)基因，并进行序列测定及同源性分析，为其进一步原核表达及相关研究奠定基础。
1 材料与方法如何快速发表论文
1．1 材料
1.1.1 质粒与菌种
标准菌株H37RvDNA由西安第四军医大学王丽梅博士友情馈赠，pGEM-T 连接载体购自Promega 公司。
1.1.2 酶与试剂
E.coli JM109感受态购自北京全式金生物技术公司，X-gal、IPTG、TaqDNA聚合酶购自Promega 公司，限制性内切酶EcoRI、XholI购自HIMERx公司，200bpDNA Marker、λDNA HindⅢ Marker购自北京华美公司，质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生物工程公司。
1.1.3 PCR引物
通过互联网GeneBank 公共数据库检索出结核分枝杆菌ESAT-6基因序列（GenBank序列号：AY208674），分别在起始端和末端设计出一对引物。
P1: 5'-CTGAATTCATGACAGAGCAGCAGTGG-3'
P2: 5'-GTCTCGAGCTATGCGAACATCCCCGC-3'
为了便于亚克隆，在引物1和引物2的两端分别引入了一个EcoRI和XholI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。
1．2 方法如何快速发表论文
1.2.1 聚合酶链反应（PCR）
反应组成为：10×Buffer（含Mg2+）2.5μL, 10mmol dNTP 0.5μL,引物1和引物2各0.5μL，DNA 2μL，TaqDNA酶0.5μL，ddH2O 18.5μL。反应条件为：94℃ 4min; 94℃ 30s, 60℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 7min。待反应结束后，将PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。
1.2.2 PCR产物的纯化与目的基因的克隆
用DNA回收试剂盒对PCR产物切胶回收。DNA与pGEM-T载体在T4连接酶的作用下，4℃连接过夜。连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，将其涂布于预先铺有(1M)IPTG和X-gal的YT平板上37℃培养过夜。
1.2.3 重组质粒的酶切鉴定
经蓝白斑筛选，挑选白色菌落 ，碱裂解法提取质粒，用EcoRI、XholI酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 DNA序列测定及特性分析
扩增片段重组质粒的序列由上海生物工程公司进行。将测序结果在NCBI/GeneBank数据库进行BLAST比较和分析。
2 结果
2.1 结核分枝杆菌ESAT-6目的基因的扩增
PCR成功扩增出特异性DNA片段，位于300bp左右，与预期结果一致，见图1。
2.2 ESAT-6/ pGEM-T/JM109重组质粒的构建及鉴定
PCR产物与pGEM-T载体连接，构建了扩增片段/ pGEM-T/JM109重组克隆体系。经酶切鉴定，得到了大约300bp的DNA片段，见图2。
2.3 ESAT-6基因测序结果及同源性比对分析
从正反两个方向对插入片段进行测序，双向测序的结果相吻合。测序结果显示ESAT-6目的片段完整开放阅读框由288bp组成。将序列与GenBank中已发表的基因（GenBank序列号：NC_010612.1）核酸序列进行比较，结果发现有2处2个碱基有所不同，同源性达99%（图3）。与 GenBank中已发表的基因（GenBank序列号：pdb|1WA8|B）氨基酸序列进行比较，同源性达90%（图4）。Query：ESAT-6基因序列 Sbjct：GenBank已发表序列
3 讨论
ESAT-6蛋白是一种MTB早期分泌蛋白，由RD1区基因Rv3875编码。通过对MTB 的早期培养滤液( STCF)和不同组分进行分析［2］，发现ESAT-6蛋白不仅存在于STCF，还存在于细胞浆和细胞壁中。Brondt等［3］发现ESAT-6蛋白可刺激结核菌感染小鼠的淋巴细胞增殖，并诱导模型小鼠的淋巴细胞有效释放IFNγ。Martin［4］的研究证明Query：ESAT-6基因序列 Sbjct：GenBank已发表序列ESAT-6蛋白可诱导结核菌感染豚鼠产生迟发型超敏反应。Pathan等［5］选用不同程度的MTB感染者为实验对象，用ESAT-6 ELISPOT方法计数外周血中分泌IFNγ的T细胞，结果发现除了未感染过MTB的人群呈阴性反应，其余各组包括TST阳性的结核病密切接触者、淋巴结核患者、痰菌阴性的肺结核患者和痰菌阳性的肺结核患者均呈阳性反应。Lalvani［6-7］研究结果也证实了ESAT-6 ELISPOT 诊断活动性结核病比PPD ELISPOT 和TST的敏感性和特异性均高，且对CPTB、弥散性结核、肺外结核以及伴有HIV阳性的结核病均有很好的诊断效果。ESAT-6蛋白的分布特异性和良好免疫原性决定其可能作为特异性抗原用于结核病诊断。
本研究通过Internet检索到GeneBank 发表的结核分支杆菌ESAT-6序列，应用PCR方法扩增出一个288bp的基因片段，同时在PCR引物设计时，分别在上、下游引物中的5’端加入了两个酶切位点来保证定向克隆；将PCR产物重组于克隆载体pGEM-T。这一过程既能保证在DNA测序时的准确性，也能保证在进一步的亚克隆到表达载体前提高双酶切的效率，同时还可长期保存和反复利用目的基因。经NCBI/BLAST分析，本研究克隆基因与GeneBank报道基因序列有99%同源性，预测为 95个氨基酸组成的ESAT-6肽链。该基因片段的获得为下一步蛋白表达、纯化及血清学诊断价值的研究工作奠定基础。
如何快速发表论文
【参考文献】
［1］Katoch VM. Newerdiagnostic techniques for tuberculosis［J］. Indian J Med Res, 2004, 120 (4): 418-428.
［2］AL Sorensen, S Nagai, G Houen, et al. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis ［J］.Infect Immun,1995, 63: 1710-1717.
［3］Brondt L, Oettinger T, Holm A, et al. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis ［J］. J Immunol, 1996, 157: 3527-3533.
［4］Martin JE, Oettinger T, Andersen P. Delayed-Type Hypersensitivity Responses to ESAT-6 and MPT64 from Mycobacterium tuberculosis in the Guinea Pig ［J］. Infect Immun, 1998, 66: 3454-3456.
［5］Pathan AA, Wilkinson KA, Klenerman P, et al. Direct Ex Vivo Analysis of Antigen-Specific IFN-Secreting CD4 T Cells in Mycobacterium tuberculosis-Infected Individuals: Associations with Clinical Disease State and Effect of Treatment［J］. J Immunol, 2001, 167:5217-5225.
［6］LalvaniA, Nagvenkar P, Udwadia Z, et al. Enumeration of T cells specific for RD1-encoded antigens suggests a high prevalence of latent Mycobacterium tuberculosis infection in healthy urban Indians［J］.J Infect Dis, 2001, 183: 469-477.
如何快速发表论文
［7］Lalvani A, Pathan A, Mcshane H, et al. Pulmonary function tuberculosis and pulmonary vascular disease: Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Infection by Enumeration of Antigen-specific T Cells［J］. Am J Respir Crit Care Med, 2001, 163: 824-828.
