僵蚕抗凝活性部位中化学成分的初步研究

【摘要】  ：目的 探索僵蚕水煎液、醇沉液和凝胶色谱馏分各部位中的抗凝活性成分。方法 用水煎煮、60%醇沉处理和凝胶色谱方法制备抗凝活性部位,用化学反应鉴别、氮测定法、电导、紫外吸收光谱和高效液相色谱方法检测各部位中的蛋白质或多肽和氨基酸类及草酸铵等成分。结果 僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分,其含量在80%以上。醇沉处理使草酸铵含量下降约52%,而多肽、氨基酸类含量仅降低约8%。凝胶色谱净化后,多肽、氨基酸类含量与水煎部位比约提高28%,与醇沉处理部位比约提高39%,而草酸铵含量与醇沉液部位相当,但比水煎煮部位降低约1倍。各部位的固形物中,15种氨基酸含量在40%～50%,占定氮法测定的蛋白质含量的60%～76%；多肽类成分的分子量为1.0～4.4 kDa。结论 本研究为僵蚕抗凝活性成分的进一步分离纯化提供了实验基础。
护理论文发表
【关键词】  僵蚕　抗凝活性部位　化学成分　凝胶色谱法　高效液相色谱法　氮测定法

　　Abstract：Objective To explore the anticoagulating active components in water extraction, alcohol sedimentation and fraction separated by gelfiltration chromatography of Bombyx Batryticatus. Methods Anticoagulating active fractions were prepared by the methods of water extraction, 70% alcohol sedimentation and gelfiltration chromatography. Components (such as porteins or polypeptide, amino acids, oxalic acid ammonium) in each fraction were determined by chemical reaction indentification, Kjeldahl method, conductance, UV and HPLC. Results Polypeptide, amino acids and oxalic acid ammonium were the main components in anticoagulating active fractions, content of which reached more than 80%. The content of oxalic acid ammonium decreased about 52% processed by alcohol sedimentation, while the content of polypeptide and amino acids only decreased about 8%. The content of peptides and amino acids increased about 28% purified by gelfiltration chromatography compared with the one in water extraction and about 39% compared with the one in alcohol sedimentation. The content of oxalic acid ammonium was the same as the one in alcohol sedimentation, but decreased about 1 time compared with the one in water extraction. The content of 15 kinds of amino acids were 40%～50% in the solids of each fractions, which maked up to 60%～76% of the content of proteins determined by Kjeldahl method. Molecular weight range of peptides is 1.0～4.4 kDa. Conclusion This study provides a experimental basis for further separation and purification of anticoagulating active components from Bombyx Batryticatus.

　　Key words：Bombyx Batryticatus；anticoagulating active fractions；chemical components；gelfiltration chromatography；HPLC；Kjeldahl method

  　  僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori L.4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体,为传统中药,性味咸、辛、平,归肝、肺、胃经[1]。具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效,可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4],其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用[5-7],草酸铵和蛋白质(或多肽)、氨基酸等可能为其主要活性成分[8]。为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分,本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析,现报道如下。

　　1  实验材料
护理论文发表
　　Waters 515 HPLC系统(Waters 公司)；BS100A自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂)；Start-4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司)；4300-Pro紫外分光光度计(瑞士安玛西亚公司)；HR2838型匀浆机(菲力普公司)；LP115 pH计(METTER TOLEDO公司)；DDS-ⅡA电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪(0.1 mL和1.0 mL,日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16和Z-26层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司,批号N25006)；兔血浆(自制)；15种氨基酸对照品(Sigma公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学试剂均为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  样品溶液的制备
   
　　称取制僵蚕1 500 g(样品A),用8倍量水浸泡过夜,以3 000 r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30 min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8 450 mL(样品B),将其浓缩至含原药材2 g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4 ℃放置过夜,3 000 r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6 g/mL,即得粗提液240 mL(样品C)。将30 mL该液加到用0.05 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱(φ2.6 cm×80 cm)上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集,2.5 mL/ (10 min·管),每2～3管按文献方法[8]测定凝血酶时间(TT,s)、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度(m/v)、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线(见图1)。将TT在40～100 s之间的组分合并得洗脱液69 mL(样品D),TT≥100 s的组分合并得洗脱液82.5 mL(样品E),E即为抗凝活性部位。

　　图1表明, 紫外吸收光谱法(UV)检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位,与UV法测得的G-25凝胶色谱峰值不重合,而按质量百分浓度(M/V)和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。

　　2.2  抗凝活性部位的化学成分理化鉴别

　　2.2.1  茚三酮反应、pH值、电导率、AgNO3/HNO3反应和CaCl2/HNO3反应  分别取B～E样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与AgNO3产生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,与CaCl2产生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。

　　2.2.2  紫外吸收光谱

　　取各样品稀释适当后在200～400 nm扫描,其紫外吸收光谱见图2。

　　图2表明,样品B～E的UV光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV光谱变化较大。
2.2.3  样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析

　　取样品E中TT≥600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脱盐,4.0 mL/(10 min·管),自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。表1  TT≥600 s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检
测结果（略）注：*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在0.2～0.8之间,计算而得

　　2.3  定量分析护理论文发表

　　2.3.1  固形物含量测定

　　精密吸取样品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密称定,按每1 mL样品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度(各样品均为n＝3,RSD不超过0.8%),结果见表2。表2  僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果（略）注：*与样品A比

　　2.3.2  指标检测

　　蛋白质：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。将该氮含量扣除铵态氮含量,再与6.25相乘,即为蛋白质质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.4%。铵根[9]：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作(40% NaOH试液用120 g/L氧化镁悬浊液代替),计算铵根质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.2%。草酸根[3]：精密取B～E样品液约5 mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定(各样品均为n＝3,RSD不超过1.0%)。结果见表3、表4。表3  僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果（略）注：*与样品B比表4  僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较（略）

　　2.3.3  HPLC法测定氨基酸含量

　　2.3.3.1  色谱条件

　　色谱柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相A为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流动相B为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脱；柱温：27 ℃；流速：1.0 mL/min；荧光检测器：λex 338 nm,λem 425 nm。
2.3.3.2  样品测定  样品溶液B～E经5.7 mol/L盐酸液,在110 ℃水解24 h,OPA试剂衍生化,然后取20 μL注入液相色谱仪。测定结果见表5。表5  僵蚕各部位中氨基酸的测定结果(略)

　　3  讨论
  
　　本研究表明,僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分。已有报道,草酸铵具有抗凝活性[8],本研究表明,凝胶色谱分离部位中不含草酸铵,但含多肽和氨基酸类成分的馏分具有抗凝活性,因此,僵蚕中的多肽类或氨基酸类成分可能是抗凝活性成分之一。本研究对僵蚕抗凝活性部位的化学成分和理化特性进行的初步探索,也为今后对僵蚕抗凝成分的分离纯化提供了实验基础。

【参考文献】
  　　[1] 张贵君.现代中药材商品通鉴[M].北京：中国中医药出版社,2001. 2447－2449.

　　[2] 卫功庆,鞠贵春,李慧萍,等.白僵蚕化学成分的分析[J].吉林农业大学学报,1995,17(3)：46－49.

　　[3] 彭新君,彭延古,曾序求,等.僵蚕提取液中蛋白质和草酸铵等成分的定量分析[J].中国中医药信息杂志,2005,12(9)：38－40.
护理论文发表
　　[4] 赵建国,彭延古,彭新君,等.薄层色谱法分离僵蚕中蛋白质和氨基酸类成分的研究[J].湖南中医学院学报,2005,25(2)：26－27.

　　[5] 彭延古,葛金文,邓奕辉,等.僵蚕抗凝活性成分的研究[J].湖南中医学院学报,2000,20(4)：18－19.

　　[6] 彭延古,曾序求,徐爱良,等.僵蚕抗内毒素所致细胞膜损伤作用研究[J].湖南中医学院学报,2004,24(3)：1－2.

　　[7] 彭延古,李露丹,邓奕辉.僵蚕抗实验性静脉血栓及作用机理的研究[J].血栓与止血,2001,20(4)：104－105.

　　[8] 赵建国,彭新君,彭延古,等.草酸铵对僵蚕抗凝作用的影响[J].时珍国医国药,2005,16(6)：468－469.

　　[9] 鲍士旦.土壤农化分析[M].第3版.北京：中国农业出版社,2002.54.

---