多柔比星对乳鼠心肌细胞TLR4/NF?κＢ信号通路的影响及地塞米松的干预实验研究
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时间：2011年3月24日 13:01
【摘要】 目的： 观察多柔比星(doxorubicin, DOX)对乳鼠心肌细胞Toll样受体4(toll?like receptor 4,TLR4）、核因子?κB（NF?κB)、肿瘤坏死因子?α(TNF?α)表达的影响，探讨多柔比星在心肌损伤中的可能发病机制及地塞米松 (dexamethasone,DXM)对其干预作用。方法： 采用体外培养乳鼠心肌细胞，用多柔比星制备心肌细胞损伤模型。随机分为3组:对照组，将心肌细胞悬液换用无血清培养基继续培养未加任何药物；DOX组，在培养液中加入多柔比星1 mg/L；DXM + DOX组，在加入DOX 1 mg/L前30 min给予地塞米松32 mg/L。作用6 h后免疫组织化学法检测心肌细胞TLR4,TNF?α蛋白表达；分别作用2,6,24 h后用Western blot法对TLR4,NF?κB,TNF?α在心肌细胞的表达水平进行半定量分析；比色法测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。结果： DOX组心肌细胞TLR4,NF?κB,TNF?α表达较对照组明显增加(P<0.01)；DXM+DOX组心肌细胞 TLR4,NF?κB,TNF?α表达水平低于DOX组(P<0.01) ；与对照组比较，DOX组的LDH活性明显增高（P<0.01,6 h组）；与DOX组比较，DXM+DOX组的LDH活性明显降低（P<0.01，6 h组）；与对照组比较，DXM+DOX组的LDH活性稍高（P<0.05，6 h组）。结论： 多柔比星作用于鼠心肌细胞，导致心肌细胞TLR4过度表达，激活其下游信号转导系统，表达细胞因子TNF?α，是其心肌细胞损伤的机制之一；DXM可以干预多柔比星心肌细胞TLR4及其下游信号转导NF?κB，TNF?α的过度表达，具有一定的心肌保护作用。如何发表论文
【关键词】 多柔比星； 心肌损伤； Toll样受体4； 核因子?κB； 肿瘤坏死因子?α； 地塞米松
［Abstract］Objective: To observe the effect of doxorubicin(DOX) on the Toll?like receptor 4（TLR4）,nuclear factor?kappa B （NF?κB）,tumor necrosis factor?alpha （TNF?α）expression of cardiac cells in newborn rats，and to discuss the possible effects of doxorubicin on myocardial damage and the intervention effects and possible mechanism of dexamethasone (DXM）on doxorubicin?injured cardiac cells. Methods： Doxorubicin was administered to establish the injury model of primary cultured cardiomyocytes in newborn rats. Primary cultured cardiomyocytes were randomly divided into three groups, control group,myocardial cell suspension was continue cultivated with serum?free medium and no drugs put into; DOX group, with doxorubicin 1 mg/L in cultured fluid; DXM+DOX group,with dexamethasone 32 mg/L and DOX 1 mg/L half an hour later in cultured fluid.The expression of TLR4,TNF?α protein in cardiac cells was checked with immunohistochemical after they were operated for 6 h . The semiquantitative analysis of TLR4,NF?κB,TNF?α protein was checked with Western blot after they were operated for 2 h, 6 h and 24 h respectively. The activity of LDH was checked in cultured fluid with colorimetry. Results： The TLR4,NF?κB,TNF?α expression of the cardiac cells in DOX group were markedly increased when compared with control group(P<0.01). The TLR4,NF?κB,TNF?α expression of cardiac cells in DXM+DOX group were considerably decreased compared with DOX group(P<0.01). Activity of LDH: Compared with control group,the activity of LDH was increased significantly in DOX group（ P<0.01,6 h group）.Compared with DOX group,the activity of LDH was decreased in DOX+DXM group significantly（P<0.01，6 h group）. Compared with control group, the activity of LDH was increased slighty in DOX+DXM group（ P<0.05，6 h group）. Conclusion： TLR4 of cardiac cells under DOX was over expressed and activating the downstream signal?transduction system, making cytokine TNF?α expressed. This is one of the cardiac cells injuring mechanism. DXM could interfere the over expression of TLR4 in cardiac cells and its downstream signal?transduction NF?κB and TNF?α, thus to protect the cardiac muscle invariably.
［Key words］doxorubicin; myocardial damage; toll?like receptor 4; NF?κB; dexamethasone; TNF?α
如何发表论文
多柔比星(doxorubicin, DOX)属于蒽环类抗生素，广泛应用于儿童白血病、淋巴瘤及实体瘤的治疗。但是，由于多柔比星具有明显的心肌毒性，使其临床应用受到限制。大量的文献显示，多柔比星导致心肌损伤的分子机制可能包括氧化应激、钙超载、线粒体损伤、核酸、蛋白质合成的抑制、心肌细胞凋亡、肾上腺功能异常、多柔比星继发性代谢产物损伤等等，但确切的发病机制尚未完全明了［1］。近年来的一些研究表明：免疫炎性损伤参与了多柔比星引起心肌损伤的病理生理过程［2,3］。随着对 Toll样受体家族的发现及其功能的逐步认识，因其在炎症反应信号转导中的重要作用，Toll样受体在心血管疾病的炎性损伤机制中所扮演的作用正成为人们关注的焦点。本研究通过制备多柔比星心肌细胞损伤模型,在多柔比星作用的第2，6，24小时，采用Western blot法观察乳鼠心肌细胞TLR4，NF?кB及TNF?α的表达，并选用地塞米松预处理，了解TLR4是否参与了多柔比星的心肌损伤及可能的信号转导途径，探讨多柔比星心肌损伤的可能机制，为临床多柔比星心肌损伤的保护提供实验及理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
二氧化碳细胞培养箱（Forma公司）；高速冷冻离心机（Heraeus公司）；蛋白垂直电泳仪及电转印系统(Bio?Rad)公司；倒置荧光显微镜(Nikon公司)；LeicaBMLB2荧光显微镜及图像分析系统(Leica公司)。
1.2 主要试剂
胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；兔抗小鼠TLR4抗体、兔抗小鼠TNF?α抗体、HRp?羊抗兔IgG(Boster 生物工程公司)；兔抗小鼠NF?κB抗体(Bioscience公司)；ABC免疫组化检测试剂盒、DAB染色试剂盒(Boster生物工程公司)；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 原代心肌细胞的分离和培养
参考Sadoshima等［4］介绍的方法加以改进，利用酶消化法培养心肌细胞，采用差速贴壁法纯化心肌细胞，用终浓度含0.25%胰蛋白酶消化液分离1～2天SD大鼠的心室肌细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，在37℃ 5% CO2培养箱中预贴壁90 min以去除非心肌细胞，吸出细胞悬液，用细胞计数板进行计数,调整细胞计数约为5×106 /ml,移入6孔培养板，接种后继续培养，24 h后更换培养液，本实验采用培养72 h后的心肌细胞。
1.4 实验分组
如何发表论文
对照组：换用无血清培养基继续培养；DOX组：DOX终浓度为1 mg/L; DXM+DOX组：在培养基中加入DXM，终浓度为32 mg/L［5］, 30 min后加入DOX，DOX终浓度为1 mg/L；分别继续培养2，6，24 h。
1.5 细胞培养上清液中LDH活性测定
乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，与2,4?二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。按相应试剂盒说明书进行。
1.6 心肌细胞TLR4，TNF?α免疫组织化学染色检测
将无菌处理的放有盖玻片的 96孔细胞培养皿，按上述实验分组加入细胞悬液；6 h后,4%低聚甲醛固定；0.3% trin?X100+13% BSA灭活内源性过氧化物酶；分别滴加1∶100的抗小鼠TLR4，TNF (兔IgG)，湿盒孵育2 h，PBS冲洗；滴加HRP?羊抗兔IgG 37℃ 30 min，PBS冲洗；滴加试剂SABC 37℃ 60 min；DAB显色，流水终止，脱水透明，封固；镜检。阳性结果判断：TLR4,TNF?α基因蛋白阳性表达采用Leica图像分析系统半定量分析方法：免疫组化阳性反应为细胞内有棕黄色颗粒沉积。低倍镜下找到视野后，调至200X，每张切片随机选择10个位点对其染色强度进行自动分析，结果用灰度值表示。灰度值越高，阳性强度越低，灰度值越低，阳性强度越高。
1.7 蛋白质印迹法检测心肌细胞TLR4，TNF?α，NF?κB的蛋白表达
心肌细胞裂解液裂解细胞，提取细胞的总蛋白质；以30 μg蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶(SDS?PAGE)电泳；电转膜方法将电泳产物转至硝酸纤维（PVDF）膜上；取出PVDF 膜，PBS冲洗，置5%牛奶中摇动2 h；分别加入1∶1000用封闭液配制“一抗”, 37℃摇动2 h；PBS冲洗后再加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG（1∶2000以封闭液配制），37℃摇动1 h；PBS冲洗后加入化学发光试剂ECL反应1 min。结果判断：PVDF膜以TYTOOPH荧光成像及分析系统扫描半定量阳性条带，蛋白表达结果经计算机图像分析，数据以表达阳性条带与内参β?肌动蛋白图像光密度值比值的均数加减标准差表示。
1.8 统计分析
采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差来表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
如何发表论文
2 结 果
2.1 地塞米松对多柔比星鼠心肌损伤LDH活性的影响
实验结果显示，DOX组LDH活性与对照组比较明显增高（P<0.01）；DXM+DOX组LDH活性较DOX组明显降低（P<0.01）。见表1。表1 心肌细胞培养液LDH活性 （略）
2.2 免疫组化法检测心肌细胞TLR4表达及地塞米松的影响
与对照组比较，DOX组TLR4蛋白表达明显增加，DXM +DOX组TLR4蛋白表达较DOX组明显减少。见表2，图1。 表2 心肌细胞TLR4，TNF?α蛋白表达及地塞米松的影响（略）
2.3 免疫组化法检测心肌细胞TNFα表达及地塞米松的影响
与对照组比较，DOX组TNF?α蛋白表达明显增加， DXM +DOX组TNF?α蛋白表达较DOX组减少。见图2，表3。
2.4 多柔比星刺激鼠心肌细胞TLR4，NF?κB，TNF?α表达及地塞米松的影响
与对照组相比，不同时间多柔比星作用于心肌细胞2 h，可见TLR4，NF?κB，TNF?α受体蛋白表达增加（P<0.01），以6 h时表达最强（P<0.01），24 h表达较6 h时降低，但仍然较对照组为高（P<0.05）。见图3，表3。表3 多柔比星刺激鼠心肌细胞TLR4，NF?κB，TNF?α蛋白表达及地塞米松的影响（略）
3 讨 论
1997年Medzhitov等［6］发现了第一个存在于人细胞表面Toll蛋白，因与果蝇Toll分子高度同源，故称为Toll样受体。TLR4是人类发现的第1个TLR相关蛋白，它是脂多糖(LPS）的特异性模式识别受体，属于Ⅰ型跨膜受体。TLR4介导的信号转导，主要包括髓样分化蛋白88 (MyD88)依赖性和非依赖性两个途径。对心肌TLRs大量研究显示：差不多各种心血管疾病都与TLRs有关，如：在培养的新生大鼠心肌细胞，发现 TLR2通过激活NF?кB介导过氧化氢诱导的细胞凋亡，相反,TLR4激活可抑制心肌细胞凋亡［7］。TLR4缺陷小鼠心肌缺血/再灌注(I/R)时, 炎症和组织损伤也明显减少，预先给予TLR4拮抗剂eritoran (E?5564) 可减轻I/R的炎症反应［8］。Nozaki等［9］也发现TLR2敲除的小鼠其多柔比星心肌损伤减轻。本实验结果亦显示，在体外心肌细胞培养损伤模型中，多柔比星分别作用于乳鼠心肌细胞2,6,24 h后，2 h即有TLR4表达增加，6 h表达明显增加，24 h后TLR4表达有所降低，提示多柔比星的心肌损伤与TLR4的过度表达有关，天然免疫反应参与了多柔比星心肌损伤的病理机制形成。越来越多的证据显示：即使没有感染存在，受损处及处于应激状态的细胞发出的信号内源性配基，也可以通过TLRs诱导天然免疫系统的促炎症反应，引发免疫应答，被称为“危险模式”免疫反应。新近的研究显示：热休克蛋白（HSP）可能为重要的内源性配基诱导天然和获得性免疫系统发生免疫应答而促进自身免疫反应的产生［10］ 。由此推测，多柔比星活化TLR４机制可能和多柔比星所致心肌细胞氧化应激损伤有关，多柔比星引发细胞膜脂质过氧化反应，使膜的结构发生改变，最终导致膜的完整性遭到破坏，细胞膜结构的损伤，导致大量内源性配体的产生及溢出，结果导致TLR4活化，表达增加。
对TLRs信号转导通路的研究显示： NF?κB是TLR4信号转导MyD88途径中重要的级联信号因子之一，TLR4受体激活，启动细胞内信号传递，活化转录因子 NF?κB,AP?1,ATF 等，促进表达合成TNF?α,IL?1,IL?6及IL?8 等炎症因子，形成炎症反应。本实验在体外多柔比星心肌细胞损伤模型中，多柔比星组NF?κB,TNF?α的表达明显增加，表明多柔比星心肌损伤与 NF?κB,TNF?α的过度活化有关。NF?κB作为TLR4信号转导途径中的重要信号转导因子，NF?κB表达的增加，提示多柔比星活化心肌细胞 TLR４引起细胞损伤的信号转导机制可能为经典MyD88依赖的信号转导途径。而TNF?α表达的增加，可激活巨噬细胞，白细胞，促进血小板激活因子、 NO、前列腺素和白三烯等的产生增加，它们相互作用引起炎症介质的过度释放，产生炎症因子的瀑布反应，加剧损伤。如何发表论文
糖皮质激素因具有快速、强大而非特异性的抗炎作用、稳定细胞膜、调节免疫机能、抑制炎症介质的释放，保护机体应激等功能，在临床上广泛应用。地塞米松是强效的抗炎物质，作为主要的免疫调节剂一直应用至今，能影响炎性级联的多重通路，能明显降低暴发性心肌炎、 严重败血症、脓毒性休克、和ARDS的死亡率。本实验选用地塞米松进行干预，在加入DOX 1 mg/L前30 min给予地塞米松32 mg/L干预。结果显示地塞米松干预组TLR４,NF?κB,TNF?α蛋白的表达水平较多柔比星组明显降低，表明地塞米松可以通过抑制 NF?κB,TNF?α的产生，抑制炎症反应，减轻细胞损伤，提示地塞米松对多柔比星心脏毒性有一定的干预作用，其干预TLR４表达的机制推测可能与地塞米松抑制炎症反应，稳定细胞膜，减轻细胞损伤，内源性配基生成减少， TLR4的活化减少继而NF?κB激活下降、TNF?α的转录、合成减少有关。但在对多柔比星药物保护的研究中亦有报道：单纯的阻断免疫机制或单纯的阻断氧化应激反应都不能完全保护多柔比星的心脏毒性，这也提示我们多柔比星的心脏毒性是多因素共同作用的结果，各有害因素间的相互作用，互为因果，构成了复杂的发病机制，进一步研究多柔比星心脏毒性的机制，探讨各有害因素间的相互作用，寻找有效的治疗方法，是我们今后研究的方向。
【参考文献】
［1］Minotti G, Menna P, Salvatorelli E, et al. Anthracyclines : molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity［J］. Pharmacol Rev, 2004,56 (2):185-229.
［2］Riad A,Bien S,Gratz M,et al.Toll?like receptor?4 deficiency attenuates doxorubicin?induced cardiomyopathy in mice［J］. Eur J Heart Fail,2008, 10(3):233-243.
［3］Sacco G,Bigioni M,Lopez G,et al.ACE inhibition and protection from doxorubicin?induced cardiotoxicity in the rat［J］ .Vascul Pharmacol,2009, 50(5-6):166-170.
［4］Sadoshima J,Jahn L,Takahashi T,et al. Molecular characterization of the stretch?induced adaptation of cultured cardiac cells. An in vitro model of load?induced cardiac hypertrophy［J］.J Biol Chem, 1992,267（15）:10551-10560.
［5］杨英珍，郭棋，金佩英，等.地塞米松对培养大鼠搏动心肌细胞感染Coxsackie B?2病毒的作用［J］. 中国药理学报,1989,10 (4)：346-349.
［6］Medzhitov R, Preston?Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］. Nature,1997,388(6640):394-397.
［7］Zhu X, Zhao H, Graveline AR,et al.MyD88 and NOS2 are essential for Toll?Like receptor?4 mediated survival effect in cardiomyocytes［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,291(4):H1900-1909.
［8］Shimamoto A,Chong AJ,Yada M, et al. Inhibition of Toll?like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia?reperfusion injury［J］.Circulation, 2006,114(1 Suppl): I270-274.
如何发表论文
［9］Nozaki N, Shishido T, Takeishi Y, et al. Modulation of doxorubicin?induced cardiac dysfunction in Toll?like receptor?2?knockout mice［J］. Circulation,2004,110(18): 2869-2874.
［10］Gelman AE, Turka LA. Autoimmunity heats up［J］. Nat Med, 2003,9 (12) : 1465-1466.
【关键词】 多柔比星； 心肌损伤； Toll样受体4； 核因子?κB； 肿瘤坏死因子?α； 地塞米松
［Abstract］Objective: To observe the effect of doxorubicin(DOX) on the Toll?like receptor 4（TLR4）,nuclear factor?kappa B （NF?κB）,tumor necrosis factor?alpha （TNF?α）expression of cardiac cells in newborn rats，and to discuss the possible effects of doxorubicin on myocardial damage and the intervention effects and possible mechanism of dexamethasone (DXM）on doxorubicin?injured cardiac cells. Methods： Doxorubicin was administered to establish the injury model of primary cultured cardiomyocytes in newborn rats. Primary cultured cardiomyocytes were randomly divided into three groups, control group,myocardial cell suspension was continue cultivated with serum?free medium and no drugs put into; DOX group, with doxorubicin 1 mg/L in cultured fluid; DXM+DOX group,with dexamethasone 32 mg/L and DOX 1 mg/L half an hour later in cultured fluid.The expression of TLR4,TNF?α protein in cardiac cells was checked with immunohistochemical after they were operated for 6 h . The semiquantitative analysis of TLR4,NF?κB,TNF?α protein was checked with Western blot after they were operated for 2 h, 6 h and 24 h respectively. The activity of LDH was checked in cultured fluid with colorimetry. Results： The TLR4,NF?κB,TNF?α expression of the cardiac cells in DOX group were markedly increased when compared with control group(P<0.01). The TLR4,NF?κB,TNF?α expression of cardiac cells in DXM+DOX group were considerably decreased compared with DOX group(P<0.01). Activity of LDH: Compared with control group,the activity of LDH was increased significantly in DOX group（ P<0.01,6 h group）.Compared with DOX group,the activity of LDH was decreased in DOX+DXM group significantly（P<0.01，6 h group）. Compared with control group, the activity of LDH was increased slighty in DOX+DXM group（ P<0.05，6 h group）. Conclusion： TLR4 of cardiac cells under DOX was over expressed and activating the downstream signal?transduction system, making cytokine TNF?α expressed. This is one of the cardiac cells injuring mechanism. DXM could interfere the over expression of TLR4 in cardiac cells and its downstream signal?transduction NF?κB and TNF?α, thus to protect the cardiac muscle invariably.
［Key words］doxorubicin; myocardial damage; toll?like receptor 4; NF?κB; dexamethasone; TNF?α
如何发表论文
多柔比星(doxorubicin, DOX)属于蒽环类抗生素，广泛应用于儿童白血病、淋巴瘤及实体瘤的治疗。但是，由于多柔比星具有明显的心肌毒性，使其临床应用受到限制。大量的文献显示，多柔比星导致心肌损伤的分子机制可能包括氧化应激、钙超载、线粒体损伤、核酸、蛋白质合成的抑制、心肌细胞凋亡、肾上腺功能异常、多柔比星继发性代谢产物损伤等等，但确切的发病机制尚未完全明了［1］。近年来的一些研究表明：免疫炎性损伤参与了多柔比星引起心肌损伤的病理生理过程［2,3］。随着对 Toll样受体家族的发现及其功能的逐步认识，因其在炎症反应信号转导中的重要作用，Toll样受体在心血管疾病的炎性损伤机制中所扮演的作用正成为人们关注的焦点。本研究通过制备多柔比星心肌细胞损伤模型,在多柔比星作用的第2，6，24小时，采用Western blot法观察乳鼠心肌细胞TLR4，NF?кB及TNF?α的表达，并选用地塞米松预处理，了解TLR4是否参与了多柔比星的心肌损伤及可能的信号转导途径，探讨多柔比星心肌损伤的可能机制，为临床多柔比星心肌损伤的保护提供实验及理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验仪器
二氧化碳细胞培养箱（Forma公司）；高速冷冻离心机（Heraeus公司）；蛋白垂直电泳仪及电转印系统(Bio?Rad)公司；倒置荧光显微镜(Nikon公司)；LeicaBMLB2荧光显微镜及图像分析系统(Leica公司)。
1.2 主要试剂
胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)；胰蛋白酶(Gibco公司)；兔抗小鼠TLR4抗体、兔抗小鼠TNF?α抗体、HRp?羊抗兔IgG(Boster 生物工程公司)；兔抗小鼠NF?κB抗体(Bioscience公司)；ABC免疫组化检测试剂盒、DAB染色试剂盒(Boster生物工程公司)；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3 原代心肌细胞的分离和培养
参考Sadoshima等［4］介绍的方法加以改进，利用酶消化法培养心肌细胞，采用差速贴壁法纯化心肌细胞，用终浓度含0.25%胰蛋白酶消化液分离1～2天SD大鼠的心室肌细胞，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中，在37℃ 5% CO2培养箱中预贴壁90 min以去除非心肌细胞，吸出细胞悬液，用细胞计数板进行计数,调整细胞计数约为5×106 /ml,移入6孔培养板，接种后继续培养，24 h后更换培养液，本实验采用培养72 h后的心肌细胞。
1.4 实验分组
如何发表论文
对照组：换用无血清培养基继续培养；DOX组：DOX终浓度为1 mg/L; DXM+DOX组：在培养基中加入DXM，终浓度为32 mg/L［5］, 30 min后加入DOX，DOX终浓度为1 mg/L；分别继续培养2，6，24 h。
1.5 细胞培养上清液中LDH活性测定
乳酸脱氢酶能催化乳酸生成丙酮酸，与2,4?二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。按相应试剂盒说明书进行。
1.6 心肌细胞TLR4，TNF?α免疫组织化学染色检测
将无菌处理的放有盖玻片的 96孔细胞培养皿，按上述实验分组加入细胞悬液；6 h后,4%低聚甲醛固定；0.3% trin?X100+13% BSA灭活内源性过氧化物酶；分别滴加1∶100的抗小鼠TLR4，TNF (兔IgG)，湿盒孵育2 h，PBS冲洗；滴加HRP?羊抗兔IgG 37℃ 30 min，PBS冲洗；滴加试剂SABC 37℃ 60 min；DAB显色，流水终止，脱水透明，封固；镜检。阳性结果判断：TLR4,TNF?α基因蛋白阳性表达采用Leica图像分析系统半定量分析方法：免疫组化阳性反应为细胞内有棕黄色颗粒沉积。低倍镜下找到视野后，调至200X，每张切片随机选择10个位点对其染色强度进行自动分析，结果用灰度值表示。灰度值越高，阳性强度越低，灰度值越低，阳性强度越高。
1.7 蛋白质印迹法检测心肌细胞TLR4，TNF?α，NF?κB的蛋白表达
心肌细胞裂解液裂解细胞，提取细胞的总蛋白质；以30 μg蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶(SDS?PAGE)电泳；电转膜方法将电泳产物转至硝酸纤维（PVDF）膜上；取出PVDF 膜，PBS冲洗，置5%牛奶中摇动2 h；分别加入1∶1000用封闭液配制“一抗”, 37℃摇动2 h；PBS冲洗后再加入二抗，即辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG（1∶2000以封闭液配制），37℃摇动1 h；PBS冲洗后加入化学发光试剂ECL反应1 min。结果判断：PVDF膜以TYTOOPH荧光成像及分析系统扫描半定量阳性条带，蛋白表达结果经计算机图像分析，数据以表达阳性条带与内参β?肌动蛋白图像光密度值比值的均数加减标准差表示。
1.8 统计分析
采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差来表示，多组间均数的比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
如何发表论文
2 结 果
2.1 地塞米松对多柔比星鼠心肌损伤LDH活性的影响
实验结果显示，DOX组LDH活性与对照组比较明显增高（P<0.01）；DXM+DOX组LDH活性较DOX组明显降低（P<0.01）。见表1。表1 心肌细胞培养液LDH活性 （略）
2.2 免疫组化法检测心肌细胞TLR4表达及地塞米松的影响
与对照组比较，DOX组TLR4蛋白表达明显增加，DXM +DOX组TLR4蛋白表达较DOX组明显减少。见表2，图1。 表2 心肌细胞TLR4，TNF?α蛋白表达及地塞米松的影响（略）
2.3 免疫组化法检测心肌细胞TNFα表达及地塞米松的影响
与对照组比较，DOX组TNF?α蛋白表达明显增加， DXM +DOX组TNF?α蛋白表达较DOX组减少。见图2，表3。
2.4 多柔比星刺激鼠心肌细胞TLR4，NF?κB，TNF?α表达及地塞米松的影响
与对照组相比，不同时间多柔比星作用于心肌细胞2 h，可见TLR4，NF?κB，TNF?α受体蛋白表达增加（P<0.01），以6 h时表达最强（P<0.01），24 h表达较6 h时降低，但仍然较对照组为高（P<0.05）。见图3，表3。表3 多柔比星刺激鼠心肌细胞TLR4，NF?κB，TNF?α蛋白表达及地塞米松的影响（略）
3 讨 论
1997年Medzhitov等［6］发现了第一个存在于人细胞表面Toll蛋白，因与果蝇Toll分子高度同源，故称为Toll样受体。TLR4是人类发现的第1个TLR相关蛋白，它是脂多糖(LPS）的特异性模式识别受体，属于Ⅰ型跨膜受体。TLR4介导的信号转导，主要包括髓样分化蛋白88 (MyD88)依赖性和非依赖性两个途径。对心肌TLRs大量研究显示：差不多各种心血管疾病都与TLRs有关，如：在培养的新生大鼠心肌细胞，发现 TLR2通过激活NF?кB介导过氧化氢诱导的细胞凋亡，相反,TLR4激活可抑制心肌细胞凋亡［7］。TLR4缺陷小鼠心肌缺血/再灌注(I/R)时, 炎症和组织损伤也明显减少，预先给予TLR4拮抗剂eritoran (E?5564) 可减轻I/R的炎症反应［8］。Nozaki等［9］也发现TLR2敲除的小鼠其多柔比星心肌损伤减轻。本实验结果亦显示，在体外心肌细胞培养损伤模型中，多柔比星分别作用于乳鼠心肌细胞2,6,24 h后，2 h即有TLR4表达增加，6 h表达明显增加，24 h后TLR4表达有所降低，提示多柔比星的心肌损伤与TLR4的过度表达有关，天然免疫反应参与了多柔比星心肌损伤的病理机制形成。越来越多的证据显示：即使没有感染存在，受损处及处于应激状态的细胞发出的信号内源性配基，也可以通过TLRs诱导天然免疫系统的促炎症反应，引发免疫应答，被称为“危险模式”免疫反应。新近的研究显示：热休克蛋白（HSP）可能为重要的内源性配基诱导天然和获得性免疫系统发生免疫应答而促进自身免疫反应的产生［10］ 。由此推测，多柔比星活化TLR４机制可能和多柔比星所致心肌细胞氧化应激损伤有关，多柔比星引发细胞膜脂质过氧化反应，使膜的结构发生改变，最终导致膜的完整性遭到破坏，细胞膜结构的损伤，导致大量内源性配体的产生及溢出，结果导致TLR4活化，表达增加。
对TLRs信号转导通路的研究显示： NF?κB是TLR4信号转导MyD88途径中重要的级联信号因子之一，TLR4受体激活，启动细胞内信号传递，活化转录因子 NF?κB,AP?1,ATF 等，促进表达合成TNF?α,IL?1,IL?6及IL?8 等炎症因子，形成炎症反应。本实验在体外多柔比星心肌细胞损伤模型中，多柔比星组NF?κB,TNF?α的表达明显增加，表明多柔比星心肌损伤与 NF?κB,TNF?α的过度活化有关。NF?κB作为TLR4信号转导途径中的重要信号转导因子，NF?κB表达的增加，提示多柔比星活化心肌细胞 TLR４引起细胞损伤的信号转导机制可能为经典MyD88依赖的信号转导途径。而TNF?α表达的增加，可激活巨噬细胞，白细胞，促进血小板激活因子、 NO、前列腺素和白三烯等的产生增加，它们相互作用引起炎症介质的过度释放，产生炎症因子的瀑布反应，加剧损伤。如何发表论文
糖皮质激素因具有快速、强大而非特异性的抗炎作用、稳定细胞膜、调节免疫机能、抑制炎症介质的释放，保护机体应激等功能，在临床上广泛应用。地塞米松是强效的抗炎物质，作为主要的免疫调节剂一直应用至今，能影响炎性级联的多重通路，能明显降低暴发性心肌炎、 严重败血症、脓毒性休克、和ARDS的死亡率。本实验选用地塞米松进行干预，在加入DOX 1 mg/L前30 min给予地塞米松32 mg/L干预。结果显示地塞米松干预组TLR４,NF?κB,TNF?α蛋白的表达水平较多柔比星组明显降低，表明地塞米松可以通过抑制 NF?κB,TNF?α的产生，抑制炎症反应，减轻细胞损伤，提示地塞米松对多柔比星心脏毒性有一定的干预作用，其干预TLR４表达的机制推测可能与地塞米松抑制炎症反应，稳定细胞膜，减轻细胞损伤，内源性配基生成减少， TLR4的活化减少继而NF?κB激活下降、TNF?α的转录、合成减少有关。但在对多柔比星药物保护的研究中亦有报道：单纯的阻断免疫机制或单纯的阻断氧化应激反应都不能完全保护多柔比星的心脏毒性，这也提示我们多柔比星的心脏毒性是多因素共同作用的结果，各有害因素间的相互作用，互为因果，构成了复杂的发病机制，进一步研究多柔比星心脏毒性的机制，探讨各有害因素间的相互作用，寻找有效的治疗方法，是我们今后研究的方向。
【参考文献】
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［3］Sacco G,Bigioni M,Lopez G,et al.ACE inhibition and protection from doxorubicin?induced cardiotoxicity in the rat［J］ .Vascul Pharmacol,2009, 50(5-6):166-170.
［4］Sadoshima J,Jahn L,Takahashi T,et al. Molecular characterization of the stretch?induced adaptation of cultured cardiac cells. An in vitro model of load?induced cardiac hypertrophy［J］.J Biol Chem, 1992,267（15）:10551-10560.
［5］杨英珍，郭棋，金佩英，等.地塞米松对培养大鼠搏动心肌细胞感染Coxsackie B?2病毒的作用［J］. 中国药理学报,1989,10 (4)：346-349.
［6］Medzhitov R, Preston?Hurlburt P, Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity［J］. Nature,1997,388(6640):394-397.
［7］Zhu X, Zhao H, Graveline AR,et al.MyD88 and NOS2 are essential for Toll?Like receptor?4 mediated survival effect in cardiomyocytes［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,291(4):H1900-1909.
［8］Shimamoto A,Chong AJ,Yada M, et al. Inhibition of Toll?like receptor 4 with eritoran attenuates myocardial ischemia?reperfusion injury［J］.Circulation, 2006,114(1 Suppl): I270-274.
如何发表论文
［9］Nozaki N, Shishido T, Takeishi Y, et al. Modulation of doxorubicin?induced cardiac dysfunction in Toll?like receptor?2?knockout mice［J］. Circulation,2004,110(18): 2869-2874.
［10］Gelman AE, Turka LA. Autoimmunity heats up［J］. Nat Med, 2003,9 (12) : 1465-1466.
