放射性核素125I与神经生长因子的偶联及条件优化
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时间：2011年3月24日 12:59
【摘要】 目的： 探讨放射性核素125I与神经生长因子（nerve growth factor,NGF）偶联的最优反应条件。方法： 采用联结标记法进行125I与神经生长因子偶联反应，在125I投料量固定为37 MBq的条件下，改变NGF的投料量分别为20，50，100，150 μg，同样的条件下反应后以三氯醋酸沉淀法计算产率。将产物保存于4℃，于1，2，3，5，7天，2，3，4周时间点检测产物的放射性化学纯度，评价产物的体外稳定性。结果： 当NGF投料量由20 μg增加到50 μg时，125I?NGF产率由76.6%迅速增加到79.0%，当继续增加NGF投料量至150 μg时，125I?NGF产率仅增加1.2%。经过连续4周观测，本标记方法的产物125I?NGF在体外4℃储存条件下未发现明显脱碘，放射化学纯度始终大于80%。结论： 125I与神经生长因子偶联的理想原料配比为37 MBq 125I与50 μg NGF进行反应，该条件下的产物125I?NGF放射性浓度为97.31 MBq/ml，放射性比活度为584.6 MBq/mg。
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【关键词】 放射性核素；神经生长因子； 联结标记法
［Abstract］Objective: To explore the optimal reaction conditions of radionuclides 125I labeling nerve growth factor(NGF). Methods： NGF was radiolabeled with 125I by indirect iodination. Keep the constant dose of 125I to be 37 MBq, the dose of NGF varied as 20, 50, 100, 150 μg, yield was figured out by TCA precipitation. Keep product in 4℃, radiochemical purity at 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7d, 2 w, 3 w, 4 w was detected by TCA precipitation. Results： Yield grew rapidly from 76.6% to 79.0% while the dose of NGF increased from 20 μg to 50 μg, with the constant increase of NGF to 150 μg, the yield increased only by 1.2%. Within 28 days′ observation, radiochemical purity of the product is above 80%. Conclusion： The best reaction condition is 37 MBq 125I with 50 μg NGF, under this condition, activity concentration of 125I?NGF is 97.31 MBq/ml, radioactivity is 584.6 MBq/mg.
［Key words］radionuclides; nerve growth factor; indirect iodination
胶质瘤是起源于神经外胚层的中枢神经系统恶性肿瘤，是成人颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤呈浸润性生长，手术几乎不能做到全切，术后肿瘤复发率高，是临床治疗难点。我们前期的研究中发现，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）在人脑胶质瘤细胞中存在过表达，并且发生核转位［1-3］。NGF核转位率与胶质瘤的恶性程度呈正相关。俄歇电子是某些放射性核素发生电子俘获衰变过程中产生的一种放射性粒子，具有高线性能量转换（linear energy transfer，LET）及超短射程（小于10 nm）的特点。产俄歇电子的放射性核素必须被输送进入细胞核内发生衰变产生俄歇电子后才能有效杀伤靶细胞［4-7］，因此，俄歇电子是理想的靶向制剂弹头。125I是产生俄歇电子效率最高的放射性核素，一个125I原子发生衰变可以产生22个俄歇电子。根据NGF在人脑胶质瘤中的表达特点及俄歇电子的放射学特性，我们设计以外源性NGF为“载体”，放射性核素125I为“弹头”，通过联结标记法得到125I?NGF，用于人脑胶质瘤的靶向治疗。通过改变投料量配比，得出了最优反应条件，并测定了产物的放射化学纯度及体外稳定性，为后期的抗胶质瘤活性研究提供基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 主要试剂
硼酸（AR）、硼砂（AR）、二甲基甲酰胺（AR）、三氯醋酸（AR）均购自上海国药集团，氯胺T（ACS）、硫代硫酸钠（GR）、重蒸苯（AR）、碘化钾（AR）均购自阿拉丁试剂公司。重组人β?NGF购自Sigma公司。高放射性核纯度的无还原剂的Na125I溶液由上海欣科医药公司进口分装。彗星试验试剂盒由广西南宁生物公司提供。3?(4?羟苯基)丙酸?N琥珀酰胺酯（Bolton?Hunter试剂）、Sephadex G10葡聚糖凝胶购自Sigma公司。快速发表论文
1.1.2 主要仪器
放射性防护工作台（扬州邗江），BT?100型恒流泵（上海琪特分析仪器公司），万分之一精密电子天平（上海精密仪器仪表公司），WTL掌上离心机（长沙湘仪），L?210型涡旋振荡器（北京来亨），五通道伽马计数器GC1500（安徽中佳）。
1.2 方法
1.2.1 125I与NGF的偶联
参照Jung等［8］的方法称取1 mg BH试剂溶解于1 ml DMF苯中，再取出0.1 ml用DMF苯稀释至1 ml，即得0.1 mg/ml BH溶液。分装入Eppendorf管中，10 μl（1μg）/管，干燥氮气吹干，-20℃保存备用。取出1支，加入37 MBq Na125I，20 μl 2 mg/ml（40 μg）氯胺T溶液，振荡混匀，室温反应1 min，加入20 μl 5 mg/ml（100 μg）硫代硫酸钠溶液，并向反应体系中加入10 μl 10 mg/ml（100 μg）碘化钾溶液，振荡混匀，终止反应。向反应体系中加入200 μl DMF苯，萃取，取出上层有机相转移入一洁净干燥Eppendorf管中，剩余水相用200 μl DMF苯重复萃取1次，合并有机相，用伽马计数器分别测量有机相和水相的伽马计数CPM。按照以下公式计算得到第一步反应标记率。重复第一次标记反应，使标记效率稳定。
标记率=有机相CPM有机相CPM+水相CPM×100%
取4支含有第一步反应产物的Eppendorf管，在通风放射防护工作台中用干燥氮气将有机相吹干，分别加入NGF 20，50，100，150 μg，以pH8.4 BBS补足反应体系为200 μl，振荡混匀，置冰浴中反应30 min，加入1 mol/L 甘氨酸溶液100 μl终止反应。取20 μl反应产物和100 μl 100 mg/ml BSA溶液加入500 μl BBS溶液中，混匀，向其中加入100 μl 100%TCA溶液，振荡混匀，4℃ 12 000×g离心10 min，取沉淀，测量沉淀以及离心前溶液总的CPM计数，按照以下公式计算第二步反应标记效率。
第二步反应标记效率=沉淀CPM离心前溶液总CPM×100%
总反应产率=第一步标记效率×第二步标记效率
重复上述试验4次，计算平均标记效率。
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1.2.2 125I?NGF体外稳定性试验
将标记产物放置在4℃冰箱内保存，分别于1 d，2 d，3 d，5 d，7 d，2 w，3 w，4 w时间点取出20 μl，采用上述TCA沉淀法测定产物的放射化学纯度，观察产物的体外稳定性。
1.2.3 统计分析
采用SPSS 11.5软件对试验数据进行统计分析，对不同NGF投料量下的产率比较采用单因素方差分析，对于方差不齐的，采用Dunnett?t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
经多次试验，本实验室第一步标记反应产率稳定在92%左右。通过稳定Na125I的投料量，改变NGF的投料量，得到的总反应产率如表1。表1 Na125I与NGF不同配比条件下125I?NGF的平均产率（略）
从图1中可以看出，当NGF投料量由20 μg增加到50 μg时，125I?NGF产率由76.6%迅速增加到79.0%，当继续增加NGF投料量至150 μg时，125I?NGF产率仅增加1.2%。散点图上可以看出曲线渐近平直。
产物125I?NGF在体外4℃储存条件下，保存1，2，3，5，7，14，21，28 d时的放射化学纯度分别为85.8%，86.2%，85.3%，85.6%，85.3%，83.3%，82.1%，80.1%。连续4周观测，未发现明显脱碘，放射化学纯度始终大于80%。
3 讨 论
联结标记法进行125I标记NGF的原理是先经第一步标记反应将Na125I溶液中的碘原子氧化为碘分子，活性碘分子可以亲核取代BH试剂的苯环上的氢原子，生成放射性125I?BH中间产物。通过萃取和蒸发，可以将125I?BH与游离碘分离，并纯化浓缩该产物。第二步反应中，将125I?BH与NGF 接触，冰浴反应，条件温和。与传统的氯胺T标记法不同，由于NGF不直接和氧化剂还原剂接触，可以避免NGF活性受损。由于第二步反应体系中无氧化剂还原剂等有毒有害物质，亦无游离125I干扰，并且经过连续4周观测，该反应产物体外4℃储存条件下未发现明显脱碘，放射化学纯度始终大于80%。因此，为了不使产物受到稀释和损失，最大限度上降低计算产物放射性浓度的误差，我们认为不必要对产物进行柱层析。
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本研究中，固定Na125I的投料量为37 MBq，当NGF投料量由20 μg增加到50 μg时，125I?NGF产率由76.6%迅速增加到79.0%，当继续增加NGF投料量，125I?NGF产率增加已不是很明显。说明在NGF投料量为 50 μg时，Na125I已几乎被充分利用。由于产率的测定是通过CPM计数的比值实现的，实际上是测量的反应产物体系中与蛋白结合的125I占Na125I 投料量的比例，即Na125I利用率。理论上讲，无限增加NGF的投料量可以无限增加Na125I的利用率，但是这会使每个NGF分子上携带的125I原子减少，并且会有大量不带放射性的NGF存在，与125I?NGF竞争，影响治疗效果。因此，从经济适用及保证125I?NGF的放射性比活度角度考虑，采用37 MBq Na125I 与50 μg NGF的反应底物配比进行后续实验。该反应条件下，产物125I?NGF的放射性浓度为97.31 MBq/ml（0.79×37 MBq/300 μl），放射性比活度为584.6 MBq/mg（0.79×37 MBq/50 μg）。
【参考文献】
［1］杨勇,彭 浩,陈超波,等. NGF及TrkA在人脑胶质瘤细胞株U251表达及其生物学意义［J］.中国临床康复,2006,38(10):94-96.
［2］张志坚,杨 勇,于 婷,等. NGF及其活化受体P?TrkA在人脑胶质瘤细胞周期中的多靶点分布模式［J］.神经解剖学杂志, 2007,23(6):577-586.
［3］Zhang Z, Yang Y, Gong A, et al. Localization of NGF and TrkA at mitotic apparatus in human glioma cell line U251［J］. Biochem Biophys Res Commun,2005,337(1):68-74.
［4］Sastry KSR. Biological effects of auger emitter 125I［J］. Med Physics, 1992,19(6):1361-1370.
［5］O′Donoghue JA. Strategies for selective targeting of auger electron emitters to tumor cells［J］. J Nucl Med, 1996,37(4Suppl):3S-6S.
［6］Riz AN, Mairs RJ, Angerson WJ, et al. Differential cytotoxicity of 123I?UdR, 125I?UdR and 131I?UdR to human glioma cells in monolayer or spheroid culture: effect of proliferative heterogeneity and radiation cross fire［J］. British J Cancer, 1998,77(3):385-390.
［7］Narra VR, Howell RW, Harapanhalli RS, et al. Radiotoxicity of some 123I, 125I and 131I labeled compounds in mouse tests: implications for radiopharmaceutical design［J］. J Nucl Med, 1992,33(12):2196-2201.
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［8］Jung KH, Kim DH, Paik JY, et al. Pharmacokinetics and biodistribution of a small radioiodine labeled nerve growth factor fragment［J］. Ann Nucl Med, 2006,20(8):535-540.
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【关键词】 放射性核素；神经生长因子； 联结标记法
［Abstract］Objective: To explore the optimal reaction conditions of radionuclides 125I labeling nerve growth factor(NGF). Methods： NGF was radiolabeled with 125I by indirect iodination. Keep the constant dose of 125I to be 37 MBq, the dose of NGF varied as 20, 50, 100, 150 μg, yield was figured out by TCA precipitation. Keep product in 4℃, radiochemical purity at 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7d, 2 w, 3 w, 4 w was detected by TCA precipitation. Results： Yield grew rapidly from 76.6% to 79.0% while the dose of NGF increased from 20 μg to 50 μg, with the constant increase of NGF to 150 μg, the yield increased only by 1.2%. Within 28 days′ observation, radiochemical purity of the product is above 80%. Conclusion： The best reaction condition is 37 MBq 125I with 50 μg NGF, under this condition, activity concentration of 125I?NGF is 97.31 MBq/ml, radioactivity is 584.6 MBq/mg.
［Key words］radionuclides; nerve growth factor; indirect iodination
胶质瘤是起源于神经外胚层的中枢神经系统恶性肿瘤，是成人颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤呈浸润性生长，手术几乎不能做到全切，术后肿瘤复发率高，是临床治疗难点。我们前期的研究中发现，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）在人脑胶质瘤细胞中存在过表达，并且发生核转位［1-3］。NGF核转位率与胶质瘤的恶性程度呈正相关。俄歇电子是某些放射性核素发生电子俘获衰变过程中产生的一种放射性粒子，具有高线性能量转换（linear energy transfer，LET）及超短射程（小于10 nm）的特点。产俄歇电子的放射性核素必须被输送进入细胞核内发生衰变产生俄歇电子后才能有效杀伤靶细胞［4-7］，因此，俄歇电子是理想的靶向制剂弹头。125I是产生俄歇电子效率最高的放射性核素，一个125I原子发生衰变可以产生22个俄歇电子。根据NGF在人脑胶质瘤中的表达特点及俄歇电子的放射学特性，我们设计以外源性NGF为“载体”，放射性核素125I为“弹头”，通过联结标记法得到125I?NGF，用于人脑胶质瘤的靶向治疗。通过改变投料量配比，得出了最优反应条件，并测定了产物的放射化学纯度及体外稳定性，为后期的抗胶质瘤活性研究提供基础。
1 材料和方法
1.1 材 料
1.1.1 主要试剂
硼酸（AR）、硼砂（AR）、二甲基甲酰胺（AR）、三氯醋酸（AR）均购自上海国药集团，氯胺T（ACS）、硫代硫酸钠（GR）、重蒸苯（AR）、碘化钾（AR）均购自阿拉丁试剂公司。重组人β?NGF购自Sigma公司。高放射性核纯度的无还原剂的Na125I溶液由上海欣科医药公司进口分装。彗星试验试剂盒由广西南宁生物公司提供。3?(4?羟苯基)丙酸?N琥珀酰胺酯（Bolton?Hunter试剂）、Sephadex G10葡聚糖凝胶购自Sigma公司。快速发表论文
1.1.2 主要仪器
放射性防护工作台（扬州邗江），BT?100型恒流泵（上海琪特分析仪器公司），万分之一精密电子天平（上海精密仪器仪表公司），WTL掌上离心机（长沙湘仪），L?210型涡旋振荡器（北京来亨），五通道伽马计数器GC1500（安徽中佳）。
1.2 方法
1.2.1 125I与NGF的偶联
参照Jung等［8］的方法称取1 mg BH试剂溶解于1 ml DMF苯中，再取出0.1 ml用DMF苯稀释至1 ml，即得0.1 mg/ml BH溶液。分装入Eppendorf管中，10 μl（1μg）/管，干燥氮气吹干，-20℃保存备用。取出1支，加入37 MBq Na125I，20 μl 2 mg/ml（40 μg）氯胺T溶液，振荡混匀，室温反应1 min，加入20 μl 5 mg/ml（100 μg）硫代硫酸钠溶液，并向反应体系中加入10 μl 10 mg/ml（100 μg）碘化钾溶液，振荡混匀，终止反应。向反应体系中加入200 μl DMF苯，萃取，取出上层有机相转移入一洁净干燥Eppendorf管中，剩余水相用200 μl DMF苯重复萃取1次，合并有机相，用伽马计数器分别测量有机相和水相的伽马计数CPM。按照以下公式计算得到第一步反应标记率。重复第一次标记反应，使标记效率稳定。
标记率=有机相CPM有机相CPM+水相CPM×100%
取4支含有第一步反应产物的Eppendorf管，在通风放射防护工作台中用干燥氮气将有机相吹干，分别加入NGF 20，50，100，150 μg，以pH8.4 BBS补足反应体系为200 μl，振荡混匀，置冰浴中反应30 min，加入1 mol/L 甘氨酸溶液100 μl终止反应。取20 μl反应产物和100 μl 100 mg/ml BSA溶液加入500 μl BBS溶液中，混匀，向其中加入100 μl 100%TCA溶液，振荡混匀，4℃ 12 000×g离心10 min，取沉淀，测量沉淀以及离心前溶液总的CPM计数，按照以下公式计算第二步反应标记效率。
第二步反应标记效率=沉淀CPM离心前溶液总CPM×100%
总反应产率=第一步标记效率×第二步标记效率
重复上述试验4次，计算平均标记效率。
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1.2.2 125I?NGF体外稳定性试验
将标记产物放置在4℃冰箱内保存，分别于1 d，2 d，3 d，5 d，7 d，2 w，3 w，4 w时间点取出20 μl，采用上述TCA沉淀法测定产物的放射化学纯度，观察产物的体外稳定性。
1.2.3 统计分析
采用SPSS 11.5软件对试验数据进行统计分析，对不同NGF投料量下的产率比较采用单因素方差分析，对于方差不齐的，采用Dunnett?t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
经多次试验，本实验室第一步标记反应产率稳定在92%左右。通过稳定Na125I的投料量，改变NGF的投料量，得到的总反应产率如表1。表1 Na125I与NGF不同配比条件下125I?NGF的平均产率（略）
从图1中可以看出，当NGF投料量由20 μg增加到50 μg时，125I?NGF产率由76.6%迅速增加到79.0%，当继续增加NGF投料量至150 μg时，125I?NGF产率仅增加1.2%。散点图上可以看出曲线渐近平直。
产物125I?NGF在体外4℃储存条件下，保存1，2，3，5，7，14，21，28 d时的放射化学纯度分别为85.8%，86.2%，85.3%，85.6%，85.3%，83.3%，82.1%，80.1%。连续4周观测，未发现明显脱碘，放射化学纯度始终大于80%。
3 讨 论
联结标记法进行125I标记NGF的原理是先经第一步标记反应将Na125I溶液中的碘原子氧化为碘分子，活性碘分子可以亲核取代BH试剂的苯环上的氢原子，生成放射性125I?BH中间产物。通过萃取和蒸发，可以将125I?BH与游离碘分离，并纯化浓缩该产物。第二步反应中，将125I?BH与NGF 接触，冰浴反应，条件温和。与传统的氯胺T标记法不同，由于NGF不直接和氧化剂还原剂接触，可以避免NGF活性受损。由于第二步反应体系中无氧化剂还原剂等有毒有害物质，亦无游离125I干扰，并且经过连续4周观测，该反应产物体外4℃储存条件下未发现明显脱碘，放射化学纯度始终大于80%。因此，为了不使产物受到稀释和损失，最大限度上降低计算产物放射性浓度的误差，我们认为不必要对产物进行柱层析。
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本研究中，固定Na125I的投料量为37 MBq，当NGF投料量由20 μg增加到50 μg时，125I?NGF产率由76.6%迅速增加到79.0%，当继续增加NGF投料量，125I?NGF产率增加已不是很明显。说明在NGF投料量为 50 μg时，Na125I已几乎被充分利用。由于产率的测定是通过CPM计数的比值实现的，实际上是测量的反应产物体系中与蛋白结合的125I占Na125I 投料量的比例，即Na125I利用率。理论上讲，无限增加NGF的投料量可以无限增加Na125I的利用率，但是这会使每个NGF分子上携带的125I原子减少，并且会有大量不带放射性的NGF存在，与125I?NGF竞争，影响治疗效果。因此，从经济适用及保证125I?NGF的放射性比活度角度考虑，采用37 MBq Na125I 与50 μg NGF的反应底物配比进行后续实验。该反应条件下，产物125I?NGF的放射性浓度为97.31 MBq/ml（0.79×37 MBq/300 μl），放射性比活度为584.6 MBq/mg（0.79×37 MBq/50 μg）。
【参考文献】
［1］杨勇,彭 浩,陈超波,等. NGF及TrkA在人脑胶质瘤细胞株U251表达及其生物学意义［J］.中国临床康复,2006,38(10):94-96.
［2］张志坚,杨 勇,于 婷,等. NGF及其活化受体P?TrkA在人脑胶质瘤细胞周期中的多靶点分布模式［J］.神经解剖学杂志, 2007,23(6):577-586.
［3］Zhang Z, Yang Y, Gong A, et al. Localization of NGF and TrkA at mitotic apparatus in human glioma cell line U251［J］. Biochem Biophys Res Commun,2005,337(1):68-74.
［4］Sastry KSR. Biological effects of auger emitter 125I［J］. Med Physics, 1992,19(6):1361-1370.
［5］O′Donoghue JA. Strategies for selective targeting of auger electron emitters to tumor cells［J］. J Nucl Med, 1996,37(4Suppl):3S-6S.
［6］Riz AN, Mairs RJ, Angerson WJ, et al. Differential cytotoxicity of 123I?UdR, 125I?UdR and 131I?UdR to human glioma cells in monolayer or spheroid culture: effect of proliferative heterogeneity and radiation cross fire［J］. British J Cancer, 1998,77(3):385-390.
［7］Narra VR, Howell RW, Harapanhalli RS, et al. Radiotoxicity of some 123I, 125I and 131I labeled compounds in mouse tests: implications for radiopharmaceutical design［J］. J Nucl Med, 1992,33(12):2196-2201.
快速发表论文
［8］Jung KH, Kim DH, Paik JY, et al. Pharmacokinetics and biodistribution of a small radioiodine labeled nerve growth factor fragment［J］. Ann Nucl Med, 2006,20(8):535-540.
