缓激肽β2受体拮抗剂在兔体外循环中的脑保护作用
【摘要】 目的： 探讨缓激肽β2受体拮抗剂HOE?140在兔体外循环中的脑保护作用。方法： 实验兔随机分成深低温停循环下选择性逆行脑灌注组(DHCA+SCP,对照组,n=15)和深低温停循环下选择性逆行脑灌注+HOE?140组 (DHCA+SCP＋HOE?140,实验组,n=15),复温后开颅取脑组织检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、干湿重比（WDR）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）、白细胞介素?1β（IL?1β）、血栓素B2(TXB2)和6?酮?前列腺素F1α(6?keto?PGF1α)含量，进行组间比较。结果： 与对照组相比,实验组SOD活性明显增强,MDA和WDR均明显下降（P<0.05）; TNF?α和IL?1β均明显下降（P<0.05）；6?keto?PGF1α/TXB2比值明显升高。结论： HOE?140在深低温停循环下选择性逆行脑灌注中能明显升高6?keto?PGF1α/TXB2比值，降低缺血再灌注损伤，有明显的脑保护作用。
如何发表论文
【关键词】 缓激肽β2受体拮抗剂； 体外循环； 深低温停循环； 脑保护； 再灌注损伤
［Abstract］Objective: To investigate the protective effects of a bradykinin β2 receptor antagonist(HOE?140) on brain in a rabbit extracorporeal circulation model.Methods： Thirty rabbits were randomly divided into 2 groups:control group(DHCA+SCP),and experiment group(DHCA+SCP＋HOE?140).Brain specimens were harvested for measurement of the wet?to?dry lung weight ratio(WDR),SOD,MDA,TNF?α,IL?1β，6?keto?PGF1α,TXB2 after the experiment. Results： Compared with control group, SOD and 6?keto?PGF1α/TXB2 of the experiment group were significantly higher than control group(P<0.05), WDR，MDA, TNF?α,IL?1β6?keto?PGF1α，TXB2 of experiment group was significantly lower than control group. Conclusion： The bradykininβ2 receptor antagonist, HOE?140, can raise 6?keto?PGF1α/TXB2 ratio, ameliorate I/R injury in a rabbit DHCA+SCP model, and had a significant protection of brain.
［Key words］ bradykinin β2 receptor antagonist； extracorporeal circulation； brain protection； ischemia reperfusion injury； deep hypothermic circulatory arrest
中枢神经系统功能障碍是主动脉瘤等需要深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest, DHCA）手术常见且严重的并发症。由于DHCA的安全时限较短，因此延长DHCA的时间，使停循环再开放后的中枢神经系统功能受损降低到最小，是体外循环的一个非常重要的环节。DHCA后神经系统功能受损一个非常重要的机制就是脑的缺血再灌注损伤，因此降低缺血再灌注损伤显得至关重要。缓激肽是激肽释放酶-激肽系统中的一种主要的激肽类物质，已证实体内缓激肽受体有β1和β2两种。β2受体在外周分布较广，血管/非血管平滑肌及心肌细胞上均有β2 受体的存在。HOE?140是一种选择性的缓激肽β2受体拮抗剂。Kumari等［1］在猫的心脏缺血再灌注模型中，发现应用缓激肽β2 受体拮抗剂HOE?140能够减轻缺血再灌注损伤。Souza等［2］在肠系膜上动脉缺血再灌注模型中，同样证实了缓激肽β2受体拮抗剂在缺血再灌注中的保护作用。既然HOE?140在其他脏器的缺血再灌注损伤中发挥如此积极的作用，那么在深低温停循环状态下能否降低脑组织的缺血再灌注损伤呢？本实验通过建立兔深低温停循环模型来证实HOE?140的脑保护作用。
1 材料和方法
1.1 材 料如何发表论文
健康新西兰大白兔30只，雌雄不拘，体质量2.3～3.1 kg［(2.7±0.3） kg］，由苏州大学实验动物中心提供，动物饲养与实验均符合卫生部《医学实验动物管理实施细则》（1998）的要求。实验前1天将兔领回，使其预先适应环境。将30只兔按随机数字表法分成对照组和实验组。
1.2 实验方法
静脉穿刺针经耳缘静脉缓慢注射1.25%戊巴比妥钠2 ml/kg麻醉，固定，监测心电图(ECG)、体温；颈前正中切口，气管切开插管，以纯氧7～10 ml/kg潮气量，40～60次/min的频率机械通气，氧流量1.5～2.5 L/min，右腹股沟切口分离右股动脉，插管监测平均动脉压(MAP)；右锁骨下切口分离右锁骨下动脉1～2 cm，置线备用。静脉肝素化(500 U/kg)，胸前正中切口剪开胸骨，切开心包显露心脏，右锁骨下动脉插动脉灌注管(深度约达无名动脉分叉处)，右心耳插房管建立体外循环，流量50～80 ml·kg-1·min-1，并行下降温度至鼻温28℃，阻升主动脉，心包腔内置冰屑维持局部低温，继续降温至鼻温18℃、脑温18℃～20℃时停循环。转流期间适当从耳缘静脉追加肝素用量，维持激活全血凝固时间>480 s。对照组于停循环后将右无名动脉、左锁骨下动脉及左颈总动脉阻断，右锁骨下动脉插管和恒流仪输出管连接，以12 ml·kg-1·min-1的流量行停循环，全程脑灌注；实验组在对照组基础上停循环,全程维持滴注缓激肽β2受体拮抗剂HOE?140(10 nmol/min)。40 min后恢复循环，体表、血液同时复温至鼻温30℃开放升主动脉；鼻温36℃时开颅取脑组织行各项检查。
1.3 主要观察指标
1.3.1 丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定
如何发表论文
首先将标本称重，冰浴中制成匀浆，用南京建成生物科技公司提供的试剂盒测定MDA和SOD。
1.3.2 肿瘤坏死因子?
α（TNF?α）和白细胞介素?1β（IL?1β）的测定 取脑组织制成匀浆，以放射免疫法测定（南京建成生物科技公司提供的试剂盒）TNF?α和IL?1β。
1.3.3 脑组织血栓素A2（TXA2）和前列环素（PGI2）的测定
取相同部位左侧脑组织1 g，制成匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液-20 ℃保存备测。由于TXA2和PGI2极不稳定，故测其稳定代谢产物血栓素B2(TXB2)和6?酮?前列腺素F1α(6?keto?PGF1α)。
1.3.4 脑干湿重比（WDR）
动物处死后迅速取左侧大脑中部脑组织，用吸水纸拭干，称重得标本湿重，将标本置入50 ℃恒温箱内，72 h后称重，24 h后再次称重，若超过1%，则于24 h后再次称重，直至两次称重差值不超过1%，则记录为干重。计算湿干重比（W/D）。
1.4 统计学分析
应用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料结果以±s表示并采用t检验。
2 结 果
2.1 SOD，MDA，WDR检测结果
与对照组比较，实验组的SOD明显升高，MDA,WDR明显降低(P<0.05)。见表1。表1 两组SOD，MDA,WDR比较（略）
如何发表论文
2.2 TNF?α和IL?1β的测定结果
与对照组相比，实验组TNF?α及IL?1β含量明显降低(P<0.05)。见表2。表2 两组TNF?α及IL?1β含量比较（略）
2.3 TXB2和6?keto?PGF1α 的测定结果
与对照组相比，实验组TXB2，6?keto?PGF1α均显著降低，6?keto?PGF1α/TXB2显著增高（P均<0.05）。见表3。表3 两组TXB2和6?keto?PGF1α比较（略）
3 讨论
HOE?140是一种选择性的缓激肽β2受体拮抗剂，其对缺血再灌注损伤的保护作用被认为是通过与其受体的结合，而减少类花生酸产物量。缓激肽通过增加细胞内的钙离子，从而激活磷脂酶A2(PLA2)。PLA2从细胞磷脂中动员花生四烯酸［3、4］，通过环氧化物酶（COX）的作用形成PGH2［5］，而 PGH2是PGI2和TXA2的共同底物。花生四烯酸亦经脂肪氧化酶的作用形成LTA4，是白细胞三烯（LT）的底物。TXA2是缺血再灌注损伤中非常重要的物质［6-8］，能诱导血小板的聚集，刺激中性粒细胞的聚集，引起血管收缩和增加血管的通透性。在脑缺血再灌注损伤中血管收缩引起微循环障碍。它同样可引起血小板和中性粒细胞在毛细血管的聚集，进一步加重微循环障碍。一些研究表明PGI2/TXA2保持一个高比值对减少缺血再灌注损伤同样重要［9-11］ 。
本次实验中可见实验组脑组织匀浆中SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，另外实验组中的TNF?α及IL?1β含量显著降低。这些指标均提示实验组的脑组织缺血再灌注损伤明显好于对照组，HOE?140有明显的脑保护作用。分析其原因，我们不难发现实验组中PGI2和TXA2的稳定代谢产物TXB2和 6?keto?PGF1α同时降低，说明了HOE?140能够同时抑制PGI2和TXA2的产生。但6?keto?PGF1α/TXB2比值的明显升高，说明HOE?140主要抑制的还是TXA2的产生，从而增加PGI2/TXA2的比值，因此能够降低缺血再灌注损伤，起到脑保护作用。
综上可见，在兔体外循环过程中加入缓激肽β2受体拮抗剂HOE?140能有效抑制体外循环过程中脑缺血再灌注损伤，从而起到明显的脑保护作用。
【参考文献】
［1］Kumari R, Maulik M, Manchanda SC, et al.Protective effect of bradykinin antagonist HOE?140 during in vivo myocardial ischemic?reperfusion injury in the cat［J］.Regul Pept, 2003, 115(3): 211-218.
［2］Souza DG, Pinho V, Pesquero JL, et al.Role of the bradykinin B2 receptor for the local and systemic inflammatory response that follows severe reperfusion injury［J］.Br J Pharmacol，2003, 139(1): 129-139.
［3］杨银治，夏时海.磷脂酶A2在炎症反应中的作用［J］.世界华人消化杂志，2006，14（8）:795-799.
［4］Akiba S, Sato T.Cellular function of calcium?independent phospholipase A2［J］.Biol Pharm Bull, 2004，27(8): 1174-1178.
如何发表论文
［5］Hamberg M, Samuelsson B.Prostaglandin endoperoxides.Novel transformation of arachidonic acid in human platelets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1974，71(9):3400-3404.
［6］Wang WT, Lin LN, Wu JZ, et al.Protective effect of ligustrazine and propofol on peri?operational liver ischemia?reperfusion injury［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2006,26(3):205-208.
［7］Hackert T, Pfeil D, Hartwig W.Platelet function in acute experimental pancreatitis induced by ischaemia?reperfusion［J］.Br J Surg,2005,92(6):724-728.
［8］Ruan Z, Shibamoto T, Shimo T, et al.Effects of platelet?activating factor and thromboxane A2 on isolated perfused guinea pig liver［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat,2004,73(1-2):73-85.
［9］Kaplan E, Diehl JT, Peterson MB, et al.Extended ex vivo preservation of the heart and lungs.Effects of acellular oxygen?carrying perfusates and indomethacin on the autoperfused working heart?lung preparation［J］.J Thorac Cardiovasc Surg,1990,100(5):687-697.
［10］Isozaki H, Okajima K, Hara H, et al.The protective effect of thromboxane A2 synthetase inhibitor against ischemic liver injury［J］.Surg Today,1994,24(5):435-440.
［11］王卫,王万铁,徐正.川芎嗪对家兔肠缺血再灌注损伤时血浆TXA2/PGI2水平的影响［J］.温州医学院学报, 2004，34（4）:255-257.
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【关键词】 缓激肽β2受体拮抗剂； 体外循环； 深低温停循环； 脑保护； 再灌注损伤
［Abstract］Objective: To investigate the protective effects of a bradykinin β2 receptor antagonist(HOE?140) on brain in a rabbit extracorporeal circulation model.Methods： Thirty rabbits were randomly divided into 2 groups:control group(DHCA+SCP),and experiment group(DHCA+SCP＋HOE?140).Brain specimens were harvested for measurement of the wet?to?dry lung weight ratio(WDR),SOD,MDA,TNF?α,IL?1β，6?keto?PGF1α,TXB2 after the experiment. Results： Compared with control group, SOD and 6?keto?PGF1α/TXB2 of the experiment group were significantly higher than control group(P<0.05), WDR，MDA, TNF?α,IL?1β6?keto?PGF1α，TXB2 of experiment group was significantly lower than control group. Conclusion： The bradykininβ2 receptor antagonist, HOE?140, can raise 6?keto?PGF1α/TXB2 ratio, ameliorate I/R injury in a rabbit DHCA+SCP model, and had a significant protection of brain.
［Key words］ bradykinin β2 receptor antagonist； extracorporeal circulation； brain protection； ischemia reperfusion injury； deep hypothermic circulatory arrest
中枢神经系统功能障碍是主动脉瘤等需要深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest, DHCA）手术常见且严重的并发症。由于DHCA的安全时限较短，因此延长DHCA的时间，使停循环再开放后的中枢神经系统功能受损降低到最小，是体外循环的一个非常重要的环节。DHCA后神经系统功能受损一个非常重要的机制就是脑的缺血再灌注损伤，因此降低缺血再灌注损伤显得至关重要。缓激肽是激肽释放酶-激肽系统中的一种主要的激肽类物质，已证实体内缓激肽受体有β1和β2两种。β2受体在外周分布较广，血管/非血管平滑肌及心肌细胞上均有β2 受体的存在。HOE?140是一种选择性的缓激肽β2受体拮抗剂。Kumari等［1］在猫的心脏缺血再灌注模型中，发现应用缓激肽β2 受体拮抗剂HOE?140能够减轻缺血再灌注损伤。Souza等［2］在肠系膜上动脉缺血再灌注模型中，同样证实了缓激肽β2受体拮抗剂在缺血再灌注中的保护作用。既然HOE?140在其他脏器的缺血再灌注损伤中发挥如此积极的作用，那么在深低温停循环状态下能否降低脑组织的缺血再灌注损伤呢？本实验通过建立兔深低温停循环模型来证实HOE?140的脑保护作用。
1 材料和方法
1.1 材 料如何发表论文
健康新西兰大白兔30只，雌雄不拘，体质量2.3～3.1 kg［(2.7±0.3） kg］，由苏州大学实验动物中心提供，动物饲养与实验均符合卫生部《医学实验动物管理实施细则》（1998）的要求。实验前1天将兔领回，使其预先适应环境。将30只兔按随机数字表法分成对照组和实验组。
1.2 实验方法
静脉穿刺针经耳缘静脉缓慢注射1.25%戊巴比妥钠2 ml/kg麻醉，固定，监测心电图(ECG)、体温；颈前正中切口，气管切开插管，以纯氧7～10 ml/kg潮气量，40～60次/min的频率机械通气，氧流量1.5～2.5 L/min，右腹股沟切口分离右股动脉，插管监测平均动脉压(MAP)；右锁骨下切口分离右锁骨下动脉1～2 cm，置线备用。静脉肝素化(500 U/kg)，胸前正中切口剪开胸骨，切开心包显露心脏，右锁骨下动脉插动脉灌注管(深度约达无名动脉分叉处)，右心耳插房管建立体外循环，流量50～80 ml·kg-1·min-1，并行下降温度至鼻温28℃，阻升主动脉，心包腔内置冰屑维持局部低温，继续降温至鼻温18℃、脑温18℃～20℃时停循环。转流期间适当从耳缘静脉追加肝素用量，维持激活全血凝固时间>480 s。对照组于停循环后将右无名动脉、左锁骨下动脉及左颈总动脉阻断，右锁骨下动脉插管和恒流仪输出管连接，以12 ml·kg-1·min-1的流量行停循环，全程脑灌注；实验组在对照组基础上停循环,全程维持滴注缓激肽β2受体拮抗剂HOE?140(10 nmol/min)。40 min后恢复循环，体表、血液同时复温至鼻温30℃开放升主动脉；鼻温36℃时开颅取脑组织行各项检查。
1.3 主要观察指标
1.3.1 丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的测定
如何发表论文
首先将标本称重，冰浴中制成匀浆，用南京建成生物科技公司提供的试剂盒测定MDA和SOD。
1.3.2 肿瘤坏死因子?
α（TNF?α）和白细胞介素?1β（IL?1β）的测定 取脑组织制成匀浆，以放射免疫法测定（南京建成生物科技公司提供的试剂盒）TNF?α和IL?1β。
1.3.3 脑组织血栓素A2（TXA2）和前列环素（PGI2）的测定
取相同部位左侧脑组织1 g，制成匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液-20 ℃保存备测。由于TXA2和PGI2极不稳定，故测其稳定代谢产物血栓素B2(TXB2)和6?酮?前列腺素F1α(6?keto?PGF1α)。
1.3.4 脑干湿重比（WDR）
动物处死后迅速取左侧大脑中部脑组织，用吸水纸拭干，称重得标本湿重，将标本置入50 ℃恒温箱内，72 h后称重，24 h后再次称重，若超过1%，则于24 h后再次称重，直至两次称重差值不超过1%，则记录为干重。计算湿干重比（W/D）。
1.4 统计学分析
应用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料结果以±s表示并采用t检验。
2 结 果
2.1 SOD，MDA，WDR检测结果
与对照组比较，实验组的SOD明显升高，MDA,WDR明显降低(P<0.05)。见表1。表1 两组SOD，MDA,WDR比较（略）
如何发表论文
2.2 TNF?α和IL?1β的测定结果
与对照组相比，实验组TNF?α及IL?1β含量明显降低(P<0.05)。见表2。表2 两组TNF?α及IL?1β含量比较（略）
2.3 TXB2和6?keto?PGF1α 的测定结果
与对照组相比，实验组TXB2，6?keto?PGF1α均显著降低，6?keto?PGF1α/TXB2显著增高（P均<0.05）。见表3。表3 两组TXB2和6?keto?PGF1α比较（略）
3 讨论
HOE?140是一种选择性的缓激肽β2受体拮抗剂，其对缺血再灌注损伤的保护作用被认为是通过与其受体的结合，而减少类花生酸产物量。缓激肽通过增加细胞内的钙离子，从而激活磷脂酶A2(PLA2)。PLA2从细胞磷脂中动员花生四烯酸［3、4］，通过环氧化物酶（COX）的作用形成PGH2［5］，而 PGH2是PGI2和TXA2的共同底物。花生四烯酸亦经脂肪氧化酶的作用形成LTA4，是白细胞三烯（LT）的底物。TXA2是缺血再灌注损伤中非常重要的物质［6-8］，能诱导血小板的聚集，刺激中性粒细胞的聚集，引起血管收缩和增加血管的通透性。在脑缺血再灌注损伤中血管收缩引起微循环障碍。它同样可引起血小板和中性粒细胞在毛细血管的聚集，进一步加重微循环障碍。一些研究表明PGI2/TXA2保持一个高比值对减少缺血再灌注损伤同样重要［9-11］ 。
本次实验中可见实验组脑组织匀浆中SOD水平显著升高，MDA水平显著降低，另外实验组中的TNF?α及IL?1β含量显著降低。这些指标均提示实验组的脑组织缺血再灌注损伤明显好于对照组，HOE?140有明显的脑保护作用。分析其原因，我们不难发现实验组中PGI2和TXA2的稳定代谢产物TXB2和 6?keto?PGF1α同时降低，说明了HOE?140能够同时抑制PGI2和TXA2的产生。但6?keto?PGF1α/TXB2比值的明显升高，说明HOE?140主要抑制的还是TXA2的产生，从而增加PGI2/TXA2的比值，因此能够降低缺血再灌注损伤，起到脑保护作用。
综上可见，在兔体外循环过程中加入缓激肽β2受体拮抗剂HOE?140能有效抑制体外循环过程中脑缺血再灌注损伤，从而起到明显的脑保护作用。
【参考文献】
［1］Kumari R, Maulik M, Manchanda SC, et al.Protective effect of bradykinin antagonist HOE?140 during in vivo myocardial ischemic?reperfusion injury in the cat［J］.Regul Pept, 2003, 115(3): 211-218.
［2］Souza DG, Pinho V, Pesquero JL, et al.Role of the bradykinin B2 receptor for the local and systemic inflammatory response that follows severe reperfusion injury［J］.Br J Pharmacol，2003, 139(1): 129-139.
［3］杨银治，夏时海.磷脂酶A2在炎症反应中的作用［J］.世界华人消化杂志，2006，14（8）:795-799.
［4］Akiba S, Sato T.Cellular function of calcium?independent phospholipase A2［J］.Biol Pharm Bull, 2004，27(8): 1174-1178.
如何发表论文
［5］Hamberg M, Samuelsson B.Prostaglandin endoperoxides.Novel transformation of arachidonic acid in human platelets［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1974，71(9):3400-3404.
［6］Wang WT, Lin LN, Wu JZ, et al.Protective effect of ligustrazine and propofol on peri?operational liver ischemia?reperfusion injury［J］.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2006,26(3):205-208.
［7］Hackert T, Pfeil D, Hartwig W.Platelet function in acute experimental pancreatitis induced by ischaemia?reperfusion［J］.Br J Surg,2005,92(6):724-728.
［8］Ruan Z, Shibamoto T, Shimo T, et al.Effects of platelet?activating factor and thromboxane A2 on isolated perfused guinea pig liver［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat,2004,73(1-2):73-85.
［9］Kaplan E, Diehl JT, Peterson MB, et al.Extended ex vivo preservation of the heart and lungs.Effects of acellular oxygen?carrying perfusates and indomethacin on the autoperfused working heart?lung preparation［J］.J Thorac Cardiovasc Surg,1990,100(5):687-697.
［10］Isozaki H, Okajima K, Hara H, et al.The protective effect of thromboxane A2 synthetase inhibitor against ischemic liver injury［J］.Surg Today,1994,24(5):435-440.
［11］王卫,王万铁,徐正.川芎嗪对家兔肠缺血再灌注损伤时血浆TXA2/PGI2水平的影响［J］.温州医学院学报, 2004，34（4）:255-257.
