冬虫夏草钙制剂对衰老小鼠的抗衰老和免疫调节作用
【摘要】 目的 研究冬虫夏草钙制剂对小鼠抗衰老和免疫调节作用，并探讨其作用机制。方法 以D?半乳糖所致亚急性衰老小鼠为模型，测定冬虫夏草钙制剂对衰老小鼠全血丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、血清谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH?Px)及白细胞介素?1、6、8(IL?1、6、8)含量。结果 ①虫草组MDA含量显著低于衰老模型组和空白对照组（P<0.05），SOD及GSH?Px活性显著高于衰老模型组和空白对照组（P<0.05）；②虫草组与衰老模型组比较，小鼠血清IL?1，IL?6水平无显著性变化，但IL?8水平升高，差异显著（P<0.05）。结论 冬虫夏草钙制剂具备抗衰老活性和免疫活性。快速发表论文
【关键词】 冬虫夏草钙制剂；抗衰老；免疫调节
【Abstract】 Objective To study anti?aging and immunoregulation effects and mechanism of calcium agent from cultured Cordyceps sinensis (CCS) on aged mice. Methods The aged mice were induced by D?galactose, they were given dose of 0.1 g/ml CCS by 0.5 ml everyday for 4 w. Then the contents of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) of blood cell and glutathione peroxidase (GSH?Px) and interleukin (IL)?1, 6, 8 in serum were measured. Results In the mice treated with CCS, the content of MDA was lower than those in model and blank group (P＜0.05), the activity of SOD and GSH?Px were ignificantly increased compared with other groups (P＜0.05). There were no significant difference of serum IL?1 and IL?6 among three experimental groups, but the CCS group could remarkably improve the activity of IL?8 (P＜0.05). Conclusions CCS shows anti?aging and immunoregulation effects on the aged mice.
快速发表论文
【Key words】 Calcium agent from cultured Cordyceps sinensis; Anti?aging; Immunoregulation
冬虫夏草菌Cordyceps sinensis属于麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属〔Cordyceps (Fr.) Link〕真菌，在抗衰老和增强免疫功能的研究中占有日益重要的地位。冬虫夏草都能增加小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬指数，使小鼠外周血及脾脏淋巴细胞增殖；还可使小鼠胸腺缩小，提高泼尼松所致免疫抑制状态小鼠的血清溶血素及脾细胞免疫溶血活性；具有明显抗疲劳、耐高温作用，可抑制肝脂质过氧化物的生成，并使红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力增高；还能提高衰老小鼠的学习记忆成绩，提高衰老小鼠肝、脑、红细胞SOD及全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)，提高脑中钠钾三磷酸腺苷酶（Na+?K+?ATP酶）活性，降低肝、脑丙二醛(MDA)含量〔1～5〕。冬虫夏草钙制剂是在人工培养的冬虫夏草菌丝体中添加CaCl2，通过真菌的生命活动将无机钙离子吸收进细胞内转化为大分子的生物螯合态活性钙。本课题组以D?半乳糖所致亚急性衰老小鼠为模型，测定了冬虫夏草钙制剂对衰老小鼠全血MDA、SOD、血清GSH?Px及白细胞介素?1、6、8(IL?1、6、8)的影响，从而验证冬虫夏草钙制剂具备免疫活性和抗衰老活性。
1 材料与方法快速发表论文
1.1 样品
冬虫夏草钙制剂，本实验室自备，Ca2+浓度为300 mg/g〔6〕,用蒸馏水配置成0.1 g/ml溶液。
1.2 试剂和仪器
紫外分光光度计：UNICO UV?2000；全自动酶标分析仪：瑞士FAME 24 /20；所有试剂盒均由美国R&D 公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1 建立衰老动物模型
昆明二级种小鼠36只，雌雄各半，随机分为3组，每组12只，分别为正常对照组、模型组、虫草组。除正常对照组每日颈后皮下注射生理盐水0.2 ml外，其余2组每日皮下注射D?半乳糖水溶液120 mg/kg连续28 d。各组动物在建模同时每日灌肠胃相应受试药剂。虫草组小鼠日给药量0.5 ml，每日一次，连续灌胃4 w（正常对照组和衰老模型组用等量生理盐水灌胃）。于末次给药30 min将小鼠断头取血，测定血清MDA、SOD、GSH?Px、IL?1、6、8的含量或活性。快速发表论文
1.3.2 MDA含量测定
取上述体外实验黏附前后的血液，制备血细胞悬浮液，用反复冻溶的办法溶解血细胞。以硫代巴比妥酸(TBA)荧光微测定法检测MDA含量，用λ=532 nm的荧光进行检测。
1.3.3 GSH?Px活性测定
采用2?硝基苯甲酸法（DTNB法），以GSH标准曲线计算。考虑到GSH，H2O2在没有酶的条件下亦可进行上述反应，故最后计算GSH?Px活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。GSH标准曲线的制作：用0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20 ml 1.0 mol/L GSH加0.61 mol/L TCA 1.6 ml，用双蒸水稀释制成浓度为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L的GSH标准液各2 ml，再在各管内依次加入0.32 mol/L Na2HPO4 2.5 ml，4 mol/L NaOH 120 μl，1.0 mol/L 二硝基苯甲酸(DTNB) 0.5 ml。以空白管校零点，于423 nm波长处比色，读取吸光度值A。快速发表论文
1.3.4 SOD测定
采用黄嘌呤氧化酶?羟胺法，依次加入待测血清(用dH2O稀释50倍)0.5 ml,dH2O 0.1 ml,基质液0.1 ml,亚硝基发生剂0.1 ml,酶溶液0.2 ml,37 ℃保温30 min。然后加入显色剂2 ml,室温放置10 min,于550 nm 波长处测定其吸光度。对照管用0.5 ml dH2O代替血清样。酶活性单位(NU)定义为在30 min内能抑制50% 黄嘌呤氧化酶催化底物氧化所需酶量,血清SOD活性以每ml 血清所含酶的活性单位数表示。
1.3.5 IL?1、6、8含量
采用双抗夹心ELISA法，末次给药后30 min将小鼠断头取血（不抗凝），静置，见血清析出后，经3 000 r/min离心10 min,取足量血清待测。分别用抗IL?1、6、8单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的IL?1、6、8分别与单抗结合,加入生物素化的抗IL?1、 6、8抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streepptavidin与生物素结合,加入酶底物邻苯二胺(OPD),出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492 nm处取吸光度〔D(λ)〕值,IL?1、6、8浓度与D(λ)成正比,用自动酶标分析仪分析结果。
1.4 统计学处理
各组数据用x±s表示，并采用单因素方差分析检验。
2 结果
快速发表论文
2.1 MDA及抗氧化酶活性含量
虫草组MDA水平明显降低（P<0.05），血中SOD水平及GSH?Px活性明显升高（P<0.05）。见表1。表1 冬虫夏草钙制剂对小鼠全血MDA、SOD和GSH?Px含量的影响(略)
2.2 冬虫夏草钙制剂对小鼠IL?1、6、8水平的影响
虫草组与衰老模型组比较，小鼠血清IL?1，IL?6水平无显著性变化，但 IL?8水平升高，差异显著（P＜0.05）。见表2。表2 冬虫夏草钙制剂对小鼠血清IL?1、6、8水平的影响(略)
3 讨论
衰老是自由基引起生物膜的脂质过氧化，导致膜组织损伤和功能失活，D?半乳糖在体内氧化产生的大量自由基超过机体的清除能力，引发脂质过氧化的链式反应，并且过氧化脂质的降解产物MDA可与游离氨基的蛋白质及核酸等形成希夫碱，使生物分子之间发生交联，导致蛋白质变性，溶解度降低，损伤细胞膜，引发神经系统的功能障碍。SOD是机体内的抗氧化酶，其作用是清除自由基堆积，使生物膜脂质过氧化，防止自由基对细胞结构的破坏。机体保护系统对各种氧化应激反应的主要特点是GSH?Px活性增加。衰老过程中肝细胞中 GSH?Px大量释放入血，催化血液中脂质过氧化物分解，防止脂质过氧化物均裂和引发脂质过氧化的链式支链反应，从而减少脂质过氧化物形成，是机体抗衰老的重要防御机制之一。
本实验表明，冬虫夏草钙制剂使血中SOD水平及GSH?Px活性明显升高，MDA水平明显降低，说明加入高剂量钙的人工冬虫夏草菌也能抑制D?半乳糖致脂类过氧化的作用，具有抗衰老活性。人体和动物的衰老和免疫防御的健全状态密切相关，免疫系统在细胞和分子水平上的适度调节可以延缓衰老〔7〕。IL反映免疫能力的作用不仅仅伴有行为的变化，而且可表现有易疲劳，应激能力，免疫能力下降。IL?1、6、8等细胞生长因子是体内调节分子，形成神经?内分泌?免疫稳定轴心，调节机体的整体生理活动。IL?1能促进胸腺细胞和T细胞增殖，主要在细胞免疫激活中发挥调节作用；IL?6参加机体炎症反应和抗感染防御机制，具有一定的调节免疫应答，调节造血系统等生物学效应；IL?8对特异和非特异的免疫反应细胞具有强烈的趋化作用。本实验结果显示，冬虫夏草钙制剂使小鼠血清IL?1、IL?6水平无显著性变化；但血清IL?8水平升高，差异显著。说明冬虫夏草钙制剂具有一定的免疫调节作用，其作用机制是能促进特异和非特异性抗体的产生。本实验只是为冬虫夏草钙制剂的抗衰老和免疫调节作用提供了一定的实验依据，其他如中枢神经系统的老化包括 DNA损伤、神经元数量等方面还需要进一步的探讨与研究，弥补酶生化测定的不足。
快速发表论文
【参考文献】
1 王根维，唐仕川，陈向伟.冬虫夏草水提物对巨噬细胞吞噬功能的实验研究〔J〕.山西医科大学学报，2000；31(1)：20?1.
2 徐曦，陈国桢.冬虫夏草对免疫及造血功能影响的实验研究〔J〕.湖南医学，1995；12(4)：202?4.
3 Koh JH，Yu KW，Suh HJ，et al.Activation of macrophages and the intestinal immune system by an orally administered decoction from cultured mycelia of Cordyceps sinens〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem，2002；66（2）：407?11.
4 Siu KM，Mak DH，Ciu PY，et al.Pharmacological basis of′Yin?nourishing′and ′Yang?invigorating′actions of Cordyceps,a Chinese tonifying herb〔J〕. Life Sci，2004；76(4)：385?95.
5 王玉华，叶加，李长龄，等.冬虫夏草提取物延缓衰老实验研究〔J〕. 中国中药杂志,2004；29(8):773?6.
6 胡征.冬虫夏草生物活性多维强化剂的制备方法〔P〕.中国专利:03106294.6,2005?06?22.
7 黄娅琳.抗衰老中药的研究〔J〕.时珍国医国药,2007；18(3):691?3.
【关键词】 冬虫夏草钙制剂；抗衰老；免疫调节
【Abstract】 Objective To study anti?aging and immunoregulation effects and mechanism of calcium agent from cultured Cordyceps sinensis (CCS) on aged mice. Methods The aged mice were induced by D?galactose, they were given dose of 0.1 g/ml CCS by 0.5 ml everyday for 4 w. Then the contents of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) of blood cell and glutathione peroxidase (GSH?Px) and interleukin (IL)?1, 6, 8 in serum were measured. Results In the mice treated with CCS, the content of MDA was lower than those in model and blank group (P＜0.05), the activity of SOD and GSH?Px were ignificantly increased compared with other groups (P＜0.05). There were no significant difference of serum IL?1 and IL?6 among three experimental groups, but the CCS group could remarkably improve the activity of IL?8 (P＜0.05). Conclusions CCS shows anti?aging and immunoregulation effects on the aged mice.
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【Key words】 Calcium agent from cultured Cordyceps sinensis; Anti?aging; Immunoregulation
冬虫夏草菌Cordyceps sinensis属于麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属〔Cordyceps (Fr.) Link〕真菌，在抗衰老和增强免疫功能的研究中占有日益重要的地位。冬虫夏草都能增加小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬指数，使小鼠外周血及脾脏淋巴细胞增殖；还可使小鼠胸腺缩小，提高泼尼松所致免疫抑制状态小鼠的血清溶血素及脾细胞免疫溶血活性；具有明显抗疲劳、耐高温作用，可抑制肝脂质过氧化物的生成，并使红细胞超氧化物歧化酶（SOD）活力增高；还能提高衰老小鼠的学习记忆成绩，提高衰老小鼠肝、脑、红细胞SOD及全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH?Px)，提高脑中钠钾三磷酸腺苷酶（Na+?K+?ATP酶）活性，降低肝、脑丙二醛(MDA)含量〔1～5〕。冬虫夏草钙制剂是在人工培养的冬虫夏草菌丝体中添加CaCl2，通过真菌的生命活动将无机钙离子吸收进细胞内转化为大分子的生物螯合态活性钙。本课题组以D?半乳糖所致亚急性衰老小鼠为模型，测定了冬虫夏草钙制剂对衰老小鼠全血MDA、SOD、血清GSH?Px及白细胞介素?1、6、8(IL?1、6、8)的影响，从而验证冬虫夏草钙制剂具备免疫活性和抗衰老活性。
1 材料与方法快速发表论文
1.1 样品
冬虫夏草钙制剂，本实验室自备，Ca2+浓度为300 mg/g〔6〕,用蒸馏水配置成0.1 g/ml溶液。
1.2 试剂和仪器
紫外分光光度计：UNICO UV?2000；全自动酶标分析仪：瑞士FAME 24 /20；所有试剂盒均由美国R&D 公司提供。
1.3 实验方法
1.3.1 建立衰老动物模型
昆明二级种小鼠36只，雌雄各半，随机分为3组，每组12只，分别为正常对照组、模型组、虫草组。除正常对照组每日颈后皮下注射生理盐水0.2 ml外，其余2组每日皮下注射D?半乳糖水溶液120 mg/kg连续28 d。各组动物在建模同时每日灌肠胃相应受试药剂。虫草组小鼠日给药量0.5 ml，每日一次，连续灌胃4 w（正常对照组和衰老模型组用等量生理盐水灌胃）。于末次给药30 min将小鼠断头取血，测定血清MDA、SOD、GSH?Px、IL?1、6、8的含量或活性。快速发表论文
1.3.2 MDA含量测定
取上述体外实验黏附前后的血液，制备血细胞悬浮液，用反复冻溶的办法溶解血细胞。以硫代巴比妥酸(TBA)荧光微测定法检测MDA含量，用λ=532 nm的荧光进行检测。
1.3.3 GSH?Px活性测定
采用2?硝基苯甲酸法（DTNB法），以GSH标准曲线计算。考虑到GSH，H2O2在没有酶的条件下亦可进行上述反应，故最后计算GSH?Px活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。GSH标准曲线的制作：用0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20 ml 1.0 mol/L GSH加0.61 mol/L TCA 1.6 ml，用双蒸水稀释制成浓度为0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 μmol/L的GSH标准液各2 ml，再在各管内依次加入0.32 mol/L Na2HPO4 2.5 ml，4 mol/L NaOH 120 μl，1.0 mol/L 二硝基苯甲酸(DTNB) 0.5 ml。以空白管校零点，于423 nm波长处比色，读取吸光度值A。快速发表论文
1.3.4 SOD测定
采用黄嘌呤氧化酶?羟胺法，依次加入待测血清(用dH2O稀释50倍)0.5 ml,dH2O 0.1 ml,基质液0.1 ml,亚硝基发生剂0.1 ml,酶溶液0.2 ml,37 ℃保温30 min。然后加入显色剂2 ml,室温放置10 min,于550 nm 波长处测定其吸光度。对照管用0.5 ml dH2O代替血清样。酶活性单位(NU)定义为在30 min内能抑制50% 黄嘌呤氧化酶催化底物氧化所需酶量,血清SOD活性以每ml 血清所含酶的活性单位数表示。
1.3.5 IL?1、6、8含量
采用双抗夹心ELISA法，末次给药后30 min将小鼠断头取血（不抗凝），静置，见血清析出后，经3 000 r/min离心10 min,取足量血清待测。分别用抗IL?1、6、8单抗包被于酶标板上,标准品和样品中的IL?1、6、8分别与单抗结合,加入生物素化的抗IL?1、 6、8抗体,形成免疫复合物连接在板上,辣根过氧化物酶标记的Streepptavidin与生物素结合,加入酶底物邻苯二胺(OPD),出现黄色,加终止液硫酸,颜色变深,在492 nm处取吸光度〔D(λ)〕值,IL?1、6、8浓度与D(λ)成正比,用自动酶标分析仪分析结果。
1.4 统计学处理
各组数据用x±s表示，并采用单因素方差分析检验。
2 结果
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2.1 MDA及抗氧化酶活性含量
虫草组MDA水平明显降低（P<0.05），血中SOD水平及GSH?Px活性明显升高（P<0.05）。见表1。表1 冬虫夏草钙制剂对小鼠全血MDA、SOD和GSH?Px含量的影响(略)
2.2 冬虫夏草钙制剂对小鼠IL?1、6、8水平的影响
虫草组与衰老模型组比较，小鼠血清IL?1，IL?6水平无显著性变化，但 IL?8水平升高，差异显著（P＜0.05）。见表2。表2 冬虫夏草钙制剂对小鼠血清IL?1、6、8水平的影响(略)
3 讨论
衰老是自由基引起生物膜的脂质过氧化，导致膜组织损伤和功能失活，D?半乳糖在体内氧化产生的大量自由基超过机体的清除能力，引发脂质过氧化的链式反应，并且过氧化脂质的降解产物MDA可与游离氨基的蛋白质及核酸等形成希夫碱，使生物分子之间发生交联，导致蛋白质变性，溶解度降低，损伤细胞膜，引发神经系统的功能障碍。SOD是机体内的抗氧化酶，其作用是清除自由基堆积，使生物膜脂质过氧化，防止自由基对细胞结构的破坏。机体保护系统对各种氧化应激反应的主要特点是GSH?Px活性增加。衰老过程中肝细胞中 GSH?Px大量释放入血，催化血液中脂质过氧化物分解，防止脂质过氧化物均裂和引发脂质过氧化的链式支链反应，从而减少脂质过氧化物形成，是机体抗衰老的重要防御机制之一。
本实验表明，冬虫夏草钙制剂使血中SOD水平及GSH?Px活性明显升高，MDA水平明显降低，说明加入高剂量钙的人工冬虫夏草菌也能抑制D?半乳糖致脂类过氧化的作用，具有抗衰老活性。人体和动物的衰老和免疫防御的健全状态密切相关，免疫系统在细胞和分子水平上的适度调节可以延缓衰老〔7〕。IL反映免疫能力的作用不仅仅伴有行为的变化，而且可表现有易疲劳，应激能力，免疫能力下降。IL?1、6、8等细胞生长因子是体内调节分子，形成神经?内分泌?免疫稳定轴心，调节机体的整体生理活动。IL?1能促进胸腺细胞和T细胞增殖，主要在细胞免疫激活中发挥调节作用；IL?6参加机体炎症反应和抗感染防御机制，具有一定的调节免疫应答，调节造血系统等生物学效应；IL?8对特异和非特异的免疫反应细胞具有强烈的趋化作用。本实验结果显示，冬虫夏草钙制剂使小鼠血清IL?1、IL?6水平无显著性变化；但血清IL?8水平升高，差异显著。说明冬虫夏草钙制剂具有一定的免疫调节作用，其作用机制是能促进特异和非特异性抗体的产生。本实验只是为冬虫夏草钙制剂的抗衰老和免疫调节作用提供了一定的实验依据，其他如中枢神经系统的老化包括 DNA损伤、神经元数量等方面还需要进一步的探讨与研究，弥补酶生化测定的不足。
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【参考文献】
1 王根维，唐仕川，陈向伟.冬虫夏草水提物对巨噬细胞吞噬功能的实验研究〔J〕.山西医科大学学报，2000；31(1)：20?1.
2 徐曦，陈国桢.冬虫夏草对免疫及造血功能影响的实验研究〔J〕.湖南医学，1995；12(4)：202?4.
3 Koh JH，Yu KW，Suh HJ，et al.Activation of macrophages and the intestinal immune system by an orally administered decoction from cultured mycelia of Cordyceps sinens〔J〕.Biosci Biotechnol Biochem，2002；66（2）：407?11.
4 Siu KM，Mak DH，Ciu PY，et al.Pharmacological basis of′Yin?nourishing′and ′Yang?invigorating′actions of Cordyceps,a Chinese tonifying herb〔J〕. Life Sci，2004；76(4)：385?95.
5 王玉华，叶加，李长龄，等.冬虫夏草提取物延缓衰老实验研究〔J〕. 中国中药杂志,2004；29(8):773?6.
6 胡征.冬虫夏草生物活性多维强化剂的制备方法〔P〕.中国专利:03106294.6,2005?06?22.
7 黄娅琳.抗衰老中药的研究〔J〕.时珍国医国药,2007；18(3):691?3.
