塞来昔布对大鼠重症急性胰腺炎血清TNF?α，IL?1β，IL?6及IL?8水平的影响
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时间：2011年3月24日 11:13
【摘要】 目的： 探讨重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠血清促炎性细胞因子TNF?α，IL?1β，IL?6和 IL?8的变化及意义，以及应用塞来昔布(celecoxib)的干预效应。方法： 胆胰管内注射5 %牛磺胆酸钠造模。将动物随机分成对照组、SAP组及塞来昔布组，各组分别于术后3,6,12和24 h 4个时间点处死大鼠,测血清淀粉酶，TNF?α，IL?1β，IL?6和IL?8水平，每次每组5只；取各组术后24 h处死大鼠的胰腺组织，行HE染色,分别观察大鼠胰腺组织病理学变化。结果： 对照组胰腺组织基本正常, SAP模型组胰腺腺泡结构严重破坏消失，塞来昔布组病理改变明显减轻；SAP组、塞来昔布组大鼠血清中TNF?α，IL?1β，IL?6和IL?8水平随病程进展而升高(P<0.01)，各时相SAP组水平明显高于对照组(P<0.01)，塞来昔布组水平明显低于SAP模型组 (P<0.01)。结论： TNF?α，IL?1β，IL?6和IL?8与SAP的进展有关，塞来昔布可以减轻SAP的炎症反应，抑制促炎性细胞因子的产生。核心论文发表网
【关键词】 重症急性胰腺炎； 促炎性细胞因子； 塞来昔布
［Abstract］ Objective: To explore the changes and significance of serum tumor necrosis factor ?α(TNF?α), interleukin ?1β(IL?1β), IL?6 and IL?8 in rats with severe acute pancreatitis(SAP), and to detect the effect of celecoxib on the changes of these serum cytokines.Methods： The SAP model was established by using retrograde injection of Sodium Taurocholate into cholangiopancreatic duct.Rats in each group were killed 3, 6, 12 and 24 h(5 rats for each time point) after operation to determine serum levels of amylase, TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8.The pancreas tissues of the rats 24 h after operation were obtained to examine histopathological changes by HE dyeing.The changes of serum TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 in different groups and different time points were detected by ELISA assay.Amylase in serum was detected by automated biochemistry analysis. Results： The pathology of control group was relatively normal. The pathological damage in rats of SAP group was very severely, but celecoxib could ameliorate the pathological damage in rats of SAP group.The levels of serum TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 in rats of SAP group were significantly higher than those of control group(P<0.01) at every time point.Compared to SAP group, the levels of TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 were significantly decreased in celecoxib group(P<0.01). Conclusion： The cytokines of TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 were involved in the pathological injury of SAP.Celecoxib can ameliorate the pathological damage and inhibit the production of proinflammatory cytokine in serum in rats of SAP.
［Key words］severe acute pancreatitis； proinflammatory cytokine； celecoxib
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种凶险的、发病急、进展快、并发症多、死亡率高的内外科急症。近年的研究表明，在SAP发展过程中炎性细胞因子起着非常重要的作用，由于促炎性细胞因子所产生的一系列连锁反应和放大效应，即瀑布效应(cascade effect)导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)，其恶化和持续坏死与病程早期促炎性细胞因子过度释放有关。
塞来昔布(celecoxib)是一种特异性COX?2抑制剂，可减少前列腺素的释放，并降低促炎性细胞因子的表达，研究认为COX?2抑制剂有可能成为新的重症胰腺炎的治疗途径［1, 2］。本研究旨在通过塞来昔布作用于大鼠SAP模型，观察干预前后促炎性细胞因子的变化，进一步探讨COX?2抑制剂对SAP治疗的可能作用。
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1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠60只，体质量230～280 g，清洁级，购自中国科学研究院上海动物中心（动物合格证号：0027610），所有大鼠均给予普通颗粒饲料喂养，自由饮水，人工光循环12 h/12 h，温度为(21±2.0)℃，湿度为(55±2)%，喂养一周后进行实验。
1.2 主要试剂及试剂盒
牛磺胆酸钠、戊巴比妥钠购自Sigma公司，COX?2抑制剂塞来昔布（辉瑞药厂提供），TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8检测试剂盒购自R&D 公司。
1.3 动物模型制备及实验分组
实验前禁食不禁水12 h，10 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉。严格消毒、铺巾，正中线剖腹，置管于胰胆管内，在微量输液泵的控制下向胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠溶液，剂量1 ml/kg，留置导管5～10 min后拔管，术后自由饮水。对照组大鼠仅作剖腹术。将动物随机分为3组：对照组、SAP组及塞来昔布(30 mg/kg)治疗组，每组各20只。治疗组将塞来昔布溶解于生理盐水，并在造模前1小时腹腔注射。SAP组和对照组注射等剂量生理盐水。
1.4 标本采集与检测
分别于术后3,6,12,24 h处死动物，每次每组5只。留取血液检测血清淀粉酶及TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8。血清淀粉酶活性用全自动生化仪测定，血清 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8采用ELISA方法检测，按说明书要求操作。留取24 h处死大鼠的胰腺组织行病理组织学检查。
1.5 统计学处理
实验结果以均数±标准差表示，用SPSS11.5统计软件进行分析，采用ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
2.1 组织病理学改变
对照组大鼠胰腺组织光镜下各时段无明显改变，胰腺腺泡细胞排列紧密，可见胰岛，无中性粒细胞浸润。SAP组大鼠胰腺小叶轮廓破坏，间质水肿，血管充血伴有红细胞渗出，随发病时间的延长出现大片胰腺细胞变性坏死，伴有大量粒细胞浸润，呈典型重症急性胰腺炎改变；塞来昔布组大鼠胰腺局部炎症反应较SAP组减轻，间质水肿减轻，腺泡坏死减少，粒细胞浸润减少。
2.2 大鼠不同时间点血清淀粉酶水平比较
SAP组大鼠血清淀粉酶在不同时间点均明显高于对照组（P<0.01），塞来昔布处理组大鼠血清淀粉酶在不同时间点均明显低于SAP组（P<0.01），见表1。
2.3 各组大鼠不同时间点血清TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8水平的比较
SAP组大鼠血清TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8浓度在不同时间点均明显高于对照组（P<0.01），塞来昔布处理组大鼠血清 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8浓度在不同时间点较SAP组均显著降低（P<0.01），见表2。表1 各组大鼠不同时间点血清淀粉酶水平比较U/L （略）表2 大鼠血清TNF?α，IL?1β，IL?6及IL?8浓度pg/mL（略）
3 讨 论
重症急性胰腺炎的发生发展是多种因素相互作用的结果。目前认为SAP实质上是细胞因子及炎性介质大量释放所致的严重的全身炎症反应综合征。近年来大量的研究表明，炎性细胞因子在导致全身炎症反应中发挥着主要作用，SAP早期过度的炎症反应也是造成SIRS和MODS的主要原因［3］。炎症反应涉及炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。炎性细胞因子包括 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8，血小板活化因子等，抗炎性细胞因子包括TGF?β和IL?10等［4,5］。
炎性细胞因子中TNF?α和IL?1β可以启动级联反应，促进其他细胞因子的分泌，这些细胞因子相互影响，产生连锁和放大效应，导致SAP的发生和发展。如损伤微循环，激活炎症细胞及诱导腺泡细胞凋亡，促使胰腺组织水肿、出血和坏死等，并且可以作用于血管内皮细胞引起全身症状如微循环障碍、休克等，在局部病变发展到全身性病理损害过程中起主要作用［6］。IL?6受内毒素，TNF?α及IL?1β等刺激后可由多种细胞产生释放，在免疫和炎症反应中执行广泛的调节功能，是预测SAP预后有价值的指标，其水平与胰腺炎的严重程度及并发症的发生率呈正相关［6］。IL?8是由单核巨噬细胞激活后分泌产生，是中性粒细胞的趋化因子，促使中性粒细胞脱颗粒及释放弹力蛋白酶，中性粒细胞释放的粒细胞弹力蛋白酶是胰腺持续坏死不可缺少的物质［7］。 IL?1β，IL?6，IL?8等联合作用即可引起全身毛细血管通透性升高,而加重微循环障碍，又可引起粒细胞浸润而损伤脏器功能和破坏生物细胞膜的稳定性，从而引起胰腺坏死。在本研究中发现，胰管内注射牛磺胆酸钠3 h后，即出现明显的炎性表现，随时间延长，出现明显的组织坏死，淀粉酶明显增加，TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8等炎性细胞因子也明显增加，并与病理改变相一致，证实TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8等炎性细胞因子参与了胰腺炎发展的过程。核心论文发表网
塞来昔布是非甾体类化合物，可选择性抑制COX?2而阻止炎性前列腺素E2类物质的产生，达到抗炎、镇痛及退热的作用,研究认为COX?2抑制剂有可能成为新的重症胰腺炎的治疗途径［1, 2］。在本研究中证实，应用塞来昔布可显著降低大鼠血清中淀粉酶、TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8水平，减轻病理改变，提示塞来昔布部分抑制重症胰腺炎的发展，有可能成为重症胰腺炎的辅助治疗药物。
【参考文献】
［1］Audia P, Feinfeld DA, Dubrow A, et al.Metformin?induced lactic acidosis and acute pancreatitis precipitated by diuretic, celecoxib, and candesartan?associated acute kidney dysfunction［J］.Clin Toxicol(Phila), 2008, 46(2): 164-166.
［2］Mennecier D, Ceppa F, Sinayoko L, et al.Acute pancreatitis after treatment by celecoxib［J］.Gastroenterol Clin Biol, 2007, 31(8-9 Pt 1):668-669.
［3］Chen P, Zhang Y, Qiao M, et al.Activated protein C, an anticoagulant polypeptide, ameliorates severe acute pancreatitis via regulation of mitogen?activated protein kinases［J］.J Gastroenterol,2007, 42(11): 887-896.
［4］瞿建国，党胜春，张建新.川芎嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜的保护作用［J］.江苏大学学报：医学版，2006，16（5）：399-403.
［5］毛正发，张建新，瞿建国，等.白细胞介素1受体拮抗剂诱导急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡机制的研究［J］.江苏大学学报:医学版，2007，17（5）：396-399.
［6］Chen XQ, Huang HG, Zhou YN, et al.The study of the relationship between interleukin gene polymorphism and the morbidity of patients with acute pancreatitis［J］.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue, 2009, 21(2):99-102.
［7］Bartel M, Hansch GM, Giese T, et al.Abnormal crosstalk between pancreatic acini and macrophages during the clearance of apoptotic cells in chronic pancreatitis［J］.J Pathol, 2008, 215(2): 195-203.核心论文发表网
【关键词】 重症急性胰腺炎； 促炎性细胞因子； 塞来昔布
［Abstract］ Objective: To explore the changes and significance of serum tumor necrosis factor ?α(TNF?α), interleukin ?1β(IL?1β), IL?6 and IL?8 in rats with severe acute pancreatitis(SAP), and to detect the effect of celecoxib on the changes of these serum cytokines.Methods： The SAP model was established by using retrograde injection of Sodium Taurocholate into cholangiopancreatic duct.Rats in each group were killed 3, 6, 12 and 24 h(5 rats for each time point) after operation to determine serum levels of amylase, TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8.The pancreas tissues of the rats 24 h after operation were obtained to examine histopathological changes by HE dyeing.The changes of serum TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 in different groups and different time points were detected by ELISA assay.Amylase in serum was detected by automated biochemistry analysis. Results： The pathology of control group was relatively normal. The pathological damage in rats of SAP group was very severely, but celecoxib could ameliorate the pathological damage in rats of SAP group.The levels of serum TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 in rats of SAP group were significantly higher than those of control group(P<0.01) at every time point.Compared to SAP group, the levels of TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 were significantly decreased in celecoxib group(P<0.01). Conclusion： The cytokines of TNF?α, IL?1β, IL?6 and IL?8 were involved in the pathological injury of SAP.Celecoxib can ameliorate the pathological damage and inhibit the production of proinflammatory cytokine in serum in rats of SAP.
［Key words］severe acute pancreatitis； proinflammatory cytokine； celecoxib
重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一种凶险的、发病急、进展快、并发症多、死亡率高的内外科急症。近年的研究表明，在SAP发展过程中炎性细胞因子起着非常重要的作用，由于促炎性细胞因子所产生的一系列连锁反应和放大效应，即瀑布效应(cascade effect)导致全身炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能障碍综合征(MODS)，其恶化和持续坏死与病程早期促炎性细胞因子过度释放有关。
塞来昔布(celecoxib)是一种特异性COX?2抑制剂，可减少前列腺素的释放，并降低促炎性细胞因子的表达，研究认为COX?2抑制剂有可能成为新的重症胰腺炎的治疗途径［1, 2］。本研究旨在通过塞来昔布作用于大鼠SAP模型，观察干预前后促炎性细胞因子的变化，进一步探讨COX?2抑制剂对SAP治疗的可能作用。
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1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠60只，体质量230～280 g，清洁级，购自中国科学研究院上海动物中心（动物合格证号：0027610），所有大鼠均给予普通颗粒饲料喂养，自由饮水，人工光循环12 h/12 h，温度为(21±2.0)℃，湿度为(55±2)%，喂养一周后进行实验。
1.2 主要试剂及试剂盒
牛磺胆酸钠、戊巴比妥钠购自Sigma公司，COX?2抑制剂塞来昔布（辉瑞药厂提供），TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8检测试剂盒购自R&D 公司。
1.3 动物模型制备及实验分组
实验前禁食不禁水12 h，10 g/L戊巴比妥钠溶液腹腔麻醉。严格消毒、铺巾，正中线剖腹，置管于胰胆管内，在微量输液泵的控制下向胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠溶液，剂量1 ml/kg，留置导管5～10 min后拔管，术后自由饮水。对照组大鼠仅作剖腹术。将动物随机分为3组：对照组、SAP组及塞来昔布(30 mg/kg)治疗组，每组各20只。治疗组将塞来昔布溶解于生理盐水，并在造模前1小时腹腔注射。SAP组和对照组注射等剂量生理盐水。
1.4 标本采集与检测
分别于术后3,6,12,24 h处死动物，每次每组5只。留取血液检测血清淀粉酶及TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8。血清淀粉酶活性用全自动生化仪测定，血清 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8采用ELISA方法检测，按说明书要求操作。留取24 h处死大鼠的胰腺组织行病理组织学检查。
1.5 统计学处理
实验结果以均数±标准差表示，用SPSS11.5统计软件进行分析，采用ANOVA单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结 果
2.1 组织病理学改变
对照组大鼠胰腺组织光镜下各时段无明显改变，胰腺腺泡细胞排列紧密，可见胰岛，无中性粒细胞浸润。SAP组大鼠胰腺小叶轮廓破坏，间质水肿，血管充血伴有红细胞渗出，随发病时间的延长出现大片胰腺细胞变性坏死，伴有大量粒细胞浸润，呈典型重症急性胰腺炎改变；塞来昔布组大鼠胰腺局部炎症反应较SAP组减轻，间质水肿减轻，腺泡坏死减少，粒细胞浸润减少。
2.2 大鼠不同时间点血清淀粉酶水平比较
SAP组大鼠血清淀粉酶在不同时间点均明显高于对照组（P<0.01），塞来昔布处理组大鼠血清淀粉酶在不同时间点均明显低于SAP组（P<0.01），见表1。
2.3 各组大鼠不同时间点血清TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8水平的比较
SAP组大鼠血清TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8浓度在不同时间点均明显高于对照组（P<0.01），塞来昔布处理组大鼠血清 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8浓度在不同时间点较SAP组均显著降低（P<0.01），见表2。表1 各组大鼠不同时间点血清淀粉酶水平比较U/L （略）表2 大鼠血清TNF?α，IL?1β，IL?6及IL?8浓度pg/mL（略）
3 讨 论
重症急性胰腺炎的发生发展是多种因素相互作用的结果。目前认为SAP实质上是细胞因子及炎性介质大量释放所致的严重的全身炎症反应综合征。近年来大量的研究表明，炎性细胞因子在导致全身炎症反应中发挥着主要作用，SAP早期过度的炎症反应也是造成SIRS和MODS的主要原因［3］。炎症反应涉及炎性细胞因子和抗炎性细胞因子。炎性细胞因子包括 TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8，血小板活化因子等，抗炎性细胞因子包括TGF?β和IL?10等［4,5］。
炎性细胞因子中TNF?α和IL?1β可以启动级联反应，促进其他细胞因子的分泌，这些细胞因子相互影响，产生连锁和放大效应，导致SAP的发生和发展。如损伤微循环，激活炎症细胞及诱导腺泡细胞凋亡，促使胰腺组织水肿、出血和坏死等，并且可以作用于血管内皮细胞引起全身症状如微循环障碍、休克等，在局部病变发展到全身性病理损害过程中起主要作用［6］。IL?6受内毒素，TNF?α及IL?1β等刺激后可由多种细胞产生释放，在免疫和炎症反应中执行广泛的调节功能，是预测SAP预后有价值的指标，其水平与胰腺炎的严重程度及并发症的发生率呈正相关［6］。IL?8是由单核巨噬细胞激活后分泌产生，是中性粒细胞的趋化因子，促使中性粒细胞脱颗粒及释放弹力蛋白酶，中性粒细胞释放的粒细胞弹力蛋白酶是胰腺持续坏死不可缺少的物质［7］。 IL?1β，IL?6，IL?8等联合作用即可引起全身毛细血管通透性升高,而加重微循环障碍，又可引起粒细胞浸润而损伤脏器功能和破坏生物细胞膜的稳定性，从而引起胰腺坏死。在本研究中发现，胰管内注射牛磺胆酸钠3 h后，即出现明显的炎性表现，随时间延长，出现明显的组织坏死，淀粉酶明显增加，TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8等炎性细胞因子也明显增加，并与病理改变相一致，证实TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8等炎性细胞因子参与了胰腺炎发展的过程。核心论文发表网
塞来昔布是非甾体类化合物，可选择性抑制COX?2而阻止炎性前列腺素E2类物质的产生，达到抗炎、镇痛及退热的作用,研究认为COX?2抑制剂有可能成为新的重症胰腺炎的治疗途径［1, 2］。在本研究中证实，应用塞来昔布可显著降低大鼠血清中淀粉酶、TNF?α，IL?1β，IL?6，IL?8水平，减轻病理改变，提示塞来昔布部分抑制重症胰腺炎的发展，有可能成为重症胰腺炎的辅助治疗药物。
【参考文献】
［1］Audia P, Feinfeld DA, Dubrow A, et al.Metformin?induced lactic acidosis and acute pancreatitis precipitated by diuretic, celecoxib, and candesartan?associated acute kidney dysfunction［J］.Clin Toxicol(Phila), 2008, 46(2): 164-166.
［2］Mennecier D, Ceppa F, Sinayoko L, et al.Acute pancreatitis after treatment by celecoxib［J］.Gastroenterol Clin Biol, 2007, 31(8-9 Pt 1):668-669.
［3］Chen P, Zhang Y, Qiao M, et al.Activated protein C, an anticoagulant polypeptide, ameliorates severe acute pancreatitis via regulation of mitogen?activated protein kinases［J］.J Gastroenterol,2007, 42(11): 887-896.
［4］瞿建国，党胜春，张建新.川芎嗪对急性坏死性胰腺炎大鼠肠黏膜的保护作用［J］.江苏大学学报：医学版，2006，16（5）：399-403.
［5］毛正发，张建新，瞿建国，等.白细胞介素1受体拮抗剂诱导急性胰腺炎大鼠胰腺腺泡细胞凋亡机制的研究［J］.江苏大学学报:医学版，2007，17（5）：396-399.
［6］Chen XQ, Huang HG, Zhou YN, et al.The study of the relationship between interleukin gene polymorphism and the morbidity of patients with acute pancreatitis［J］.Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue, 2009, 21(2):99-102.
［7］Bartel M, Hansch GM, Giese T, et al.Abnormal crosstalk between pancreatic acini and macrophages during the clearance of apoptotic cells in chronic pancreatitis［J］.J Pathol, 2008, 215(2): 195-203.核心论文发表网
