甘肃党参水提物对衰老模型小鼠脑细胞凋亡及相关基因表达的影响

【摘要】  　　目的 研究甘肃党参水提物对衰老模型小鼠脑细胞凋亡及相关基因表达的影响,初步明确其延缓衰老的作用机制。方法 50只昆明种小鼠随即分为５组，分别为青年对照组，D?半乳糖衰老模型组及党参低、中、高剂量组； 采用D?半乳糖致亚急性衰老小鼠模型,测定各组小鼠各剂量胸腺指数和脾脏指数；流式细胞仪观察海马细胞凋亡的变化；免疫组化法检测Bcl?2基因在海马及皮质神经元中的表达。结果 甘肃党参水提取物与衰老模型组比较，小鼠胸腺、脾指数明显升高（P＜0.05）；抑制脑细胞凋亡；使细胞凋亡抑制基因Bcl?2的表达上调，党参水提物各组海马结构及皮质神经元内Bcl?2表达阳性比衰老模型组强。结论 党参水提物可提高机体免疫功能，上调Bcl?2的表达，抑制神经细胞凋亡。如何发表论文

【关键词】  党参;D?半乳糖;衰老;细胞凋亡;Bcl?2

　　衰老是一种由遗传因素和环境多种复杂因素相互作用而引起的生物学过程，表现为一系列随年龄而显示的全身性、渐进性、衰退性的变化或紊乱〔1〕。20世纪后期，随着老年医学引入分子生物学与细胞生物学理论与技术，衰老机制的研究也开始从整体水平发展到了分子水平〔2〕。中药在延缓衰老的过程中发挥愈来愈大的优势〔3，4〕。党参(CPN)是健脾益气药，可以增强体质,提高人体免疫力,具有延缓衰老、抗氧化、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、增强记忆和提高学习能力等功能，其延缓衰老的作用与抗氧化、清除自由基、抗缺氧以及影响组织细胞中超氧化物歧化酶 (SOD)活性、丙二醛(MDA)含量有关〔4〕。CPN作为一多来源、多品种、多规格的中药材,所含化学成分众多，地理环境、种植方法、生长状况及加工工艺等方面的变化对药材自身的品质、药材中间体及中成药的质量有很大影响〔5〕。甘肃CPN水提物对D?半乳糖所致衰老小鼠脑细胞凋亡的作用未见报道。本实验根据中医衰老学说结合现代衰老理论，探讨健脾益气药CPN在延缓衰老中的作用，为中医药延缓衰老理论提供实验依据。
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　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物

　　健康昆明种小鼠50只,2月龄，雌雄各半,体重（20±2）g,购自甘肃中医学院实验动物中心。

　　1.2  药品与试剂

　　CPN购自甘肃惠仁堂药业，制成含生药浓度为1 g/ml的水煎剂，置4℃备用；D?半乳糖购自北京索莱宝科技有限公司（产品编号 D810?25）；Bcl?2测定试剂盒(购自武汉博士德公司)，其余试剂均为国产分析纯试剂。

　　1.3  动物分组及造模

　　区分雌雄，随机分为5组，即青年组，D?半乳糖衰老模型组及CPN低、中、高剂量组，每组10只小鼠。CPN低、中、高剂量组及D?半乳糖衰老模型组，每日每只小鼠颈背部皮下注射5%D?半乳糖溶液，注射量为0.025 ml/g，青年组，注射同体积量生理盐水，共42 d。CPN治疗各组每日上午分别按相当于生药量15、10、5 g/kg灌服党参水提液。按体重调整给药量，连续42 d。
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　　1.4  胸腺、脾脏指数的测定

　　将各组小鼠急性断头处死,迅速剖取胸腺、脾，用生理盐水洗净，吸干，用电子天平称重，以脏器湿重(mg/g)表示胸腺指数、脾指数。

　　1.5  细胞凋亡的流式细胞仪检测

　　将各组小鼠急性断头处死,迅速剖取脑的海马部分，将其置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液(Gibco)中制成细胞悬液，96目尼龙网过滤，立即于80%乙醇中固定(4℃，30 min)，然后取出，PBS洗2次，加RNAase(0.5 mg/ml) 消化，37℃ 30 min，加入PI(2.5 μg/ml) 染色，流式细胞仪检测，计算G0/G1期之前的A0峰(凋亡峰)，以峰值面积计算凋亡量。

　　1.6  免疫组化法检测Bcl?2基因的表达

　　将各组小鼠急性断头处死，打开颅腔，取出脑，用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片厚5 μm，切片贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，常规脱蜡至水，3% H2O2中和内源性过氧化氢酶，切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，加热至沸腾，热修复抗原，冷却后PBS洗涤，用5% BSA封闭液封闭无关抗原后，加一抗：兔抗小鼠Bcl?2，4 ℃过夜，经PBS洗涤，再加生物素化二抗，37℃ 20 min，PBS 洗涤，滴加SABC，37℃ 20 min，DAB 显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，镜检。
1.7  数据分析

　　计数资料用x±s表示，采用SPSS软件进行t检验。
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　　2  结果

　　2.1  CPN水提物对D?半乳糖所致衰老小鼠胸腺指数、脾指数的影响

　　与青年组相比较，衰老模型组胸腺、脾指数均显著下降（P<0.01）；与衰老模型组比较，CPN水提物各浓度组小鼠胸腺、脾指数均显著高于衰老模型组，见表1。表1  CPN水提物对D?半乳糖所致衰老小鼠胸腺、脾脏指数的影响(略)

　　2.2  流式细胞仪观察海马细胞凋亡的变化

　　衰老模型组神经细胞在正常二倍体细胞DNA峰之前显示较大的A0峰，青年组A0峰很小，CPN水提物各组A0峰有不同程度的减小，高剂量组对D?半乳糖所致衰老小鼠海马细胞凋亡抑制效果最强，各组动物海马细胞凋亡率见表2。

　　2.3  免疫组化法检测Bcl?2基因的表达

　　免疫组化法检测Bcl?2基因的表达时以细胞核不着色，胞质被染成棕色者为基因表达阳性细胞。用BI?2000图像分析系统进行图像分析，

　　CPN水提物各组海马结构及皮质细胞内Bcl?2表达阳性比衰老模型组强，青年组、高剂量组有强阳性表达，其中高剂量组、中剂量组与青年组阳性表达无显著差异，中剂量组阳性表达强度中等，低剂量组有弱阳性表达，衰老模型组表达极弱，见表2，图1。表2  CPN水提物对D?半乳糖所致衰老小鼠脑组织细胞凋亡及Bcl?2基因表达的检测(略)

　　3  讨论
   
　　一般认为中枢神经系统的变化，在老年行为与其他变化中起着更为重要的作用。衰老的机制还不完全清楚,现代衰老理论提出了自由基学说,免疫衰弱学说、细胞凋亡学说、端粒和端粒酶学说、一氧化氮(NO)理论及脂褐质积累学说等,从分子水平可将衰老理解为一系列基因活动变化的结果，也是组成器官和组织的细胞在达到最大增殖能力后,其生物学功能进行性衰退的结果。细胞凋亡可参与许多与年龄相关的神经退化性疾病的致病机制，是生物衰老过程中的一个显著特征。虽然对神经系统损伤和细胞凋亡的康复尚缺乏满意的特异性治疗方法，但许多研究也证实了中药在改善大脑记忆功能、拮抗脑细胞凋亡方面有明显效果〔7～10〕。
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　　本研究发现与青年组相比较，衰老模型组胸腺、脾指数均显著下降，CPN水提物各浓度组胸腺、脾指数均显著高于衰老模型组，表明甘肃CPN水提物能增高D?半乳糖所致衰老小鼠胸腺指数、脾指数。
  
　　Bcl?2是目前研究较多的衰老相关原癌基因,其表达可抑制多种组织的凋亡和延长细胞寿命,故称其为凋亡抑制基因〔6〕。衰老模型组脑组织中的 Bcl?2基因表达下调，CPN水提物各组海马结构及皮质神经元内Bcl?2基因表达上调，阳性表达比衰老模型组强，与衰老模型组比较有显著差异，青年对照组、高剂量组有强阳性表达，中剂量组阳性表达强度中等，其中高剂量组、中剂量组与青年对照组阳性表达无显著差异，低剂量组有弱阳性表达,衰老模型组表达极弱，结果与流式细胞检测到的细胞凋亡率一致。Bcl?2基因在特定脑区表达异常增加,这种表达上调可能是机体对神经退变性病变的一种补偿机制，也是神经细胞为了保持自身功能的一种自稳机制〔11〕。
  
　　本实验表明甘肃CPN水提物具有对抗机体免疫器官退化，提高脑组织中 Bcl?2基因表达的作用，提示CPN水提物可能通过提高机体免疫功能，上调Bcl?2细胞凋亡抑制基因的表达，抑制神经细胞凋亡来延缓衰老，其有效成分及上调Bcl?2基因表达的机制有待进一步研究。

【参考文献】
  　　1 韩明向.现代中医延缓衰老学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2004：10.

　　2 叶 芳,苑伟政.基于基因表达谱芯片的人参对衰老脑组织作用研究〔J〕.西北工业大学学报，2006；24（5）：667?70.

　　3 韩明向，涂晋文.现代中医延缓衰老学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2004:78.

　　4 周坤福.黄芪和枸杞子延缓衰老的研究〔D〕.南京中医药大学，2005.

　　5 冯 丽,韩桂茹,杨建红,等.薄层扫描法测定党参中党参甙Ⅰ的含量〔J〕.中国中药杂志,1992；17(5)：300.

　　6 陈克克.中药党参的研究概况〔J〕.西安文理学院学报（自然科学版），2008；11（2）：33?9.

　　7 曾小莉，涂植光.细胞凋亡基因调控机制研究进展〔J〕.国外医学·临床生物化学与检验学分册,1999；20(2)：60221.
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　　8 张鹏霞，汤晓丽，朴金花，等.何首乌对D?半乳糖致衰老大鼠的抗衰益智作用机制的研究〔J〕.中国康复医学杂志，2005；20（4）：251?3.

　　9 王鸿飞，战丽彬，郑连杰，等.滋补脾阴方药对大鼠脊髓损伤后IL?β、caspase?3 表达及细胞凋亡的影响〔J〕.中国康复医学杂志，2005；20（7）：511?3.

　　10 韩晓琳,张宗玉,童坦君.衰老过程中原癌基因及抑癌基因的表达谱〔J〕.生理科学进展,2002；33(2):1262?301.

　　11 赖新生，王 黎，唐纯志.电针对实验性血管性痴呆大鼠学习记忆能力和脑组织细胞凋亡的影响〔J〕.中国康复医学杂志，2003；18（3）：140?3.

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