何首乌饮对D?半乳糖所致衰老大鼠下颌下腺β?半乳糖苷酶表达的影响

【摘要】  　　目的 通过观察何首乌饮干预的衰老大鼠下颌下腺β?半乳糖苷酶（β?gal）表达的改变，探讨何首乌饮的抗衰老作用。方法 用D?半乳糖制造衰老大鼠模型，何首乌饮的干预作用分治疗和预防两部分，检测β?半乳糖苷酶活性，观察下颌下腺衰老细胞数目改变。结果 预防性实验部分：模型组衰老细胞数目多于正常组和各预防性用药组；治疗性实验部分：用药各组与自然恢复组相比，衰老细胞数目明显减少，其中治疗中剂量组最低。结论 何首乌饮具有抗模型大鼠下颌下腺细胞衰老的作用。代理发表论文

【关键词】  何首乌；D?半乳糖；衰老大鼠；下颌下腺；β?半乳糖苷酶

　　【Abstract】  Objective  To investigate the apoptosis of submandibular glandular cells and the effects of Heshouwuyin on the expressions of β?galactosidase in submandibular glands of aging rats. Methods  D?galactose senescence model was adop
ted in this research. The effects of Heshouwuyi were divided into two parts: preventive and treatment experiment. The β?galactosidase activity was detected.Results  Experimental part of the prevention, the number of the aging positive cel
ls in model submandibular glands was significantly higher than that of normal and preventing groups. Part of the treatment experiment, the number of the aging positive cells in treatment groups was lower than that of self?restoring groups.
Conclusions  Heshouwuy can obviously delay aging of model rats′ submandibular gland.
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　　【Key words】  Heshouwu; D?galactose; Aging rat; Submandibular gland; β?galactosidase

　　衰老是在生物发育成熟后，随年龄的增加，机体的器官、组织出现功能、形态的退变乃至老化的过程。下颌下腺是具有外分泌和内分泌双重功能的腺体，能够分泌70%的唾液和近50种生物活性物质，其分泌的某些生物活性物质完全达到激素水平，对机体多种组织、器官有重要的支持、营养及调节作用。近年来，关于下颌下腺功能的研究逐渐深入，但对其衰老与抗衰老的研究却少有报道。本实验采用D?半乳糖诱发的亚急性衰老模型，通过对β?半乳糖苷酶活性的检测，观察下颌下腺衰老细胞数目的改变；探讨何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺的影响，为何首乌饮在延缓组织退行性改变、增强老年性保健、预防衰老性涎腺疾病方面奠定研究基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与仪器

　　何首乌饮方剂由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成，由本院贾春华教授提供；实验大鼠购自河北省实验动物中心，合格证编号：605106。

　　1.2  实验动物的选择及分组

　　选用8周龄清洁级SD雌性大鼠90只，体重180～220 g，随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组9只。
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　　1.3  模型的建立及各组动物的处理方法

　　预防性用药部分：正常组(N)大鼠正常喂60 d；模型组(M)大鼠腹腔注射D?半乳糖（300 mg·kg-1·d-1），连续 60 d；何首乌饮（H
SWY）预防高(Ph)、中(Pm)、低 (Pl) 剂量组大鼠腹腔注射D?半乳糖的同时分别灌胃何首乌饮（3.872，1.936，0.968 g·100 g-1·d-1，水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1），每天1次，连续60 d。治疗性用药部分：阴性对照组(NC)大鼠按0.5 ml·100 g-1·d-1腹腔注射生理盐水，连续60 d后灌胃生理盐水0.6 ml·100 g-1·d-1，连续60 d。自然恢复组(S?R)大鼠腹腔注射D?半乳糖，连续60 d后正常喂养60 d。HSWY治疗高(Th)、中(Tm)、低(Tl)剂量组大鼠腹腔注射D?半乳糖，连续60 d后分别灌胃何首乌饮（剂量同上），每天1次，连续60 d。
1.4  新鲜标本的取材

　　各组大鼠末次给药后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤，分离并摘取下颌下腺，置液氮中保存备用。

　　1.5  组织衰老特异性β?

　　半乳糖苷酶冰冻切片的制备及染色  准备厚为10 μm的冰冻切片，按照试剂说明书的要求，操作完成后封片即刻在光学显微镜下观察和计数,表达β?半乳糖苷酶活性的地方呈蓝色，每组取3张切片，每张切片随机观察3个视野，计算视野中每100个细胞中阳性细胞率。

　　1.6  统计学方法

　　资料分析采用SPSS11.0统计软件完成。计量资料描述采用x±s，组间比较行单因素方差分析，组间多重比较用SNK?q检验。

　　2  结果代理发表论文

　　β?半乳糖苷酶检测显示胞浆呈深蓝色者为阳性细胞(图1)，表明细胞处于衰老状态。方差分析结果显示，预防性实验部分的组间β?半乳糖苷酶表达，M组衰老细胞数目多于N组和各预防性用药组，差异有统计学意义（P<0.01）；治疗性实验部分的组间β?半乳糖苷酶表达，用药各组与S?R组相比，衰老细胞数目明显减少（P<0.01），其中Tm组最低差异有统计学意义（P<0.01），见表1。表1  预防组及治疗组大鼠下颌下腺β?半乳糖苷酶的表达(略)

　　3  讨论
  
　　1995年，Dimiri等〔1〕发现体外培养的人二倍体成纤维细胞在pH为6时，β?半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加，因此他们把这种中性β?半乳糖苷酶，定义为衰老相关的β?半乳糖苷酶。并提出这种中性β? 半乳糖苷酶是一种很好的可用于体内外衰老研究的生物学标志。1999年，Pendergrass〔2〕对不同年龄恒河猴的皮肤组织切片进行衰老相关β?半乳糖苷酶染色检测，发现其阳性率有随龄增加的趋势。本研究应用冰冻切片检测β?半乳糖苷酶在下颌下腺表达的改变。发现HSWY作用后，与模型组相比，衰老细胞数目明显减少，延缓了衰老细胞群体死亡的发生，从而延长了细胞的生存时间。
  
　　传统的中医学认为，脾肾亏虚夹瘀是衰老的基本病机，作用于衰老的全部过程，因而以补肾健脾，活血化瘀为治法预防及延缓衰老，标本兼治，使补正不敛邪，祛邪不伤正，从而达到防衰老的效果。HSWY由《宣明论方》何首乌正丸加味而成，正是通过补肾（炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿），补脾（茯苓），活血化瘀（丹参）药物而达到补肝肾、兼健脾活血化瘀、延年益寿之功效〔3，4〕。医学研究表明，HSWY配方中的6味草药均为常用的抗衰老药物，具有明显的抗衰老作用，本实验结果亦证实其具有抗下颌下腺细胞衰老的作用，但尚不能解释其机制。

【参考文献】
  　　1 Dimiri GP，Lee X，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1995；92（1）：93?6.代理发表论文

　　2 Pendergrass WR，Lane MA，Bodkin NL,et al.Cellular proliferation potential during aging and caloric restration in rhesus monkeys〔J〕.J Cell Phsiol，1999；180（1）：123?30.

　　3 谭颖然.何首乌的抗衰老作用机制探讨〔J〕.湖南中医药导报，2004；10（3）：73?4.

　　4 罗瑞芝，贾维，赵利斌，等.何首乌研究进展〔J〕.中草药，2005；36（7）：1097?100.

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