雷公藤内酯醇对AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响

【摘要】  　　目的 探讨雷公藤内酯醇（TP）对阿尔茨海默病（AD）模型大鼠海马神经细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响。方法 健康雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组及用药组。模型组给予双侧海马各一次性注射凝聚态Aβ1－40，Morris水迷宫实验判断模型成功与否。对照组大鼠双侧海马注射等量生理盐水。用药组大鼠在模型制作成功后每日腹腔注射TP 0.4 mg/kg，共15 d。应用流式细胞仪、TUNEL染色、透射电镜技术检测各组大鼠海马神经细胞凋亡的变化，免疫组织化学法检测各组大鼠海马神经细胞细胞色素C和Bcl?2 蛋白表达的变化。结果 用药组大鼠海马神经细胞凋亡率较模型组明显降低（P<0.01），TUNEL染色阳性细胞数较模型组明显减少（P<0.01）；用药组大鼠海马细胞色素C阳性产物数和平均光密度均较模型组明显减少P<0.01），Bcl?2阳性细胞数和平均光密度均较模型组明显增加（P<0.01）。结论 TP对AD模型大鼠海马神经细胞凋亡有抑制作用，其机制可能与TP增加AD模型大鼠海马神经细胞Bcl?2蛋白表达、减少细胞色素C的释放有关。教师职称论文发表

【关键词】  雷公藤内酯醇；β?淀粉样蛋白；神经细胞凋亡；阿尔茨海默病

　　【Abstract】  Objective  To explore the effect of triptolide(TP) on the neuronal apoptosis and the expression of apoptosis?related proteins in hippocampus of AD model rats. Methods  Healthy male SD rats were randomly divided into control, AD model and TP?treated groups. The AD model group was made by bilateral microinjection of Aβ1?40 into hippocampus in rats and Morris water maze test was used to judge the models success or not. The control group was made by bilateral microinjection of normal saline into hippocampus in rats.The TP?treated group rats were administered TP (0.4 mg·kg-1·d-1) intraperitoneally after the AD model was made successfully. 15 days later,the changes of neuronal apoptosis in hippocampus of each group were observed with flow cytometry and TUNEL staining and transmission electron microscopy, and the changes of cytochrome C and Bcl?2 protein expression in hippocampus of each group were observed by immunohistochemical staining. Results  Compared with those of the AD model group,the apoptosis rate of neurons and the cell number of TUNEL positive staining in hippocampus of the TP?treated group were significantly decreased(P＜0.01). The number and average optical density of cytochrome c positive products in hippocampus of the TP?treated group were obviously lower than those of the AD model group (P＜0.01), and the cell number and average optical density of Bcl?2 positive staining were obviously higher than those of the AD model group (P＜0.01). Conclusions  TP can inhibit the neuronal apoptosis in hippocampus of the AD model group.Its mechanism  may concern increasing the Bcl?2 expression and reducing the release of cytochrome c in hippocampus of the AD model group.
   
　　【Key words】  Alzheimer′s disease；β?amyloid protein；Neuronal apoptosis；Triptolide

　　凋亡介导准确的、程序性的神经细胞自然死亡，是中枢神经系统发育过程中神经细胞发生的重要生理过程。然而，过早凋亡和/或凋亡的调控失常与神经退行性变的发病机制有关，可导致各种慢性疾病发生，如阿尔茨海默病(AD) 〔1〕。β淀粉样蛋白(Aβ)的代谢异常和沉积是AD发生和发展的关键性因素。离体和在体实验表明Aβ与神经细胞凋亡关系密切，Aβ可诱导神经细胞凋亡。神经细胞凋亡被认为是AD中神经元大量丢失的主要原因之一〔2〕。因此，减轻Aβ诱导的神经细胞凋亡可改善AD的预后。最近的研究发现雷公藤内酯醇(TP）可通过抗炎和免疫抑制作用，减轻Aβ所致AD模型大鼠脑内的免疫炎症反应，改善AD大鼠的学习记忆能力〔3〕。本实验采用流式细胞术、TUNEL染色、透射电镜技术及免疫组织化学染色,研究TP对Aβ1?40所致AD 模型大鼠海马神经细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响，为进一步阐明TP对AD模型大鼠神经细胞保护性作用及机制提供实验依据。教师职称论文发表

　　1  材料与方法

　　1.1  药品与试剂

　　TP（纯度为99.8%，批号070929，福建省医学科学研究所，溶于4%丙二醇溶液中，经200目过滤器滤过除菌后备用）；Aβ1－40(Sigma公司)；TUNEL试剂盒（Promega公司）；PI染色（BD公司）；鼠抗细胞色素C和鼠抗Bcl?2单克隆抗体(Santa Cruz 公司)；SP试剂盒(Zymed公司)；DAB显色试剂盒（北京中杉公司）。

　　1.2  仪器

　　江湾Ⅰ型C 大鼠脑立体定位仪（上海川沙花木农机厂）；微量进样器（上海安亭科学仪器厂）；冰冻切片机YD?1508 Ⅲ（浙江金华益迪医疗设备厂）；BD流式细胞仪FACSCalibur（美国BD公司）；手术显微镜SXP?1C（上海医疗器械股份有限公司）；Image?Pro Plus v 6.0显微图像分析系统（Media Cybernetics公司）。

　　1.3  Aβ1－40的孵育

　　无菌生理盐水将Aβ1?40稀释成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其变为凝聚态Aβ1－40。4℃冰箱保存备用。

　　1.4  动物分组与处理 教师职称论文发表

　　健康雄性4月龄的SD大鼠，体重250～275 g，由南昌大学医学院实验动物中心提供，标准环境饲养。用Morris水迷宫初筛，去除先天痴呆和游泳姿势不良者。随机抽取Morris水迷宫初筛合格的 SD大鼠，参照包新民等的《大鼠脑立体定位图谱》，于双侧海马（以Bregma点为0点，AP?3.0 mm，ML?2.0 mm，DV?2.9 mm）各缓慢注射1 μl生理盐水，设为对照组，为11只。其余合格大鼠给予双侧海马（注射部位同上）各一次性注射凝聚态Aβ1?40 1 μl制备AD模型〔3〕,在术后1 w进行Morris水迷宫实验,以对照组大鼠逃避潜伏期均值的95%上限值为标准,将超出上限值者确定为痴呆大鼠。选出造模成功者随机分为模型组和用药组,每组12只。用药组每日腹腔注射TP 0.4 mg/kg，共15 d。对照组和模型组每天腹腔注射等容积4%丙二醇溶液，注射时间同用药组。

　　1.5  流式细胞仪检测

　　药物干预结束后，每组各取5只动物，腹腔麻醉后断头取脑，PBS清洗干净，取出海马，在手术显微镜下去除海马包膜和血管。将海马剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，0.25%胰蛋白酶·PBS溶液37℃反复消化，收集消化液并用含有10%小牛血清的DMEM培养液终止反应，离心（1 000 r/min）5 min，倒掉上清液，收集沉底的细胞重悬于PBS中，制成1×106的单细胞悬液，300目筛网过滤，保留滤液并用70%乙醇4℃固定1 h，PBS洗去固定液，用PI染液染色，4℃避光30 min，上机用流式细胞仪检凋亡细胞的百分率。

　　1.6  取材、固定及冰冻切片

　　药物干预结束后，每组各取5只动物，腹腔麻醉后经左心室插管至主动脉，常规灌注固定，在海马注射点附近连续冠状面冰冻切片，片厚20 μm，相邻切片分4套，分别进行甲苯胺蓝染色、TUNEL染色及细胞色素C和Bcl?2免疫组织化学染色。教师职称论文发表

　　1.7  甲苯胺蓝染色

　　将切片裱片于载玻片上，室温下干燥。PBS浸洗；1%甲苯胺蓝中，50℃浸染20 min；冷却后蒸馏水洗； 70%酒精中分化1 min；95%酒精分化（分化时间以显微镜下观察尼氏体呈深蓝色为度）； 100%酒精迅速脱水；透明；中性树胶封片；在显微镜下观察海马结构的变化并拍片。

　　1.8  TUNEL染色

　　按Promega  DeadEndTM  Colorimetric TUNEL System 说明书操作。步骤如下：PBS清洗切片，渗透反应液冰上反应5 min，PBS清洗，滴加混合反应液保湿箱37℃反应60 min，PBS 清洗,DAB显色，脱水、透明，中性明胶封片。各组动物每张切片随机抽取10个不相重叠的视野，在显微镜下计数TUNEL染色阳性细胞数。

　　1.9  免疫组织化学染色

　　采用SP法，步骤如下：3% H2O2液10 min；正常山羊血清37℃ 15 min，倾去；分别滴加鼠抗Bcl?2（1∶200）和鼠抗细胞色素C（1∶300）抗体4℃过夜；生物素标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)37 ℃ 30 min；辣根酶标记链霉卵白素液(1∶100)37 ℃ 30 min；DAB显色；脱水；透明；中性明胶封片。PBS代替一抗作为阴性对照。每只大鼠随机取3张切片，每张切片在注射区附近随机抽取３个不相重叠的视野，在显微镜下采用Image?Pro plus v６.０图像分析系统测出细胞色素C阳性产物数、Bcl?2阳性细胞数及两者的平均光密度。
1.10  电镜观察 教师职称论文发表

　　药物干预结束后，取5只动物（对照组1只、模型组2只、用药组2只），用含4%多聚甲醛·2.5%戊二醛的PB经左心室灌注固定，参照脑立体定位图谱在每例动物的海马区注射点附近各取1个1 mm×1 mm×1 mm组织块，入上述固定液再固定3～4 h，常规包埋，半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜定位后，再做成超薄切片，经醋酸铀、枸橼酸铅双染色，H?600透射电镜观察神经细胞超微结构与凋亡有关的变化。

　　1.11  数据处理

　　所得数据以x±s表示，采用统计软件SSPS13.0，组间数据比较用单因素方差分析（One?way ANOVA）。

　　2  结果

　　2.1  甲苯胺蓝染色

　　对照组大鼠海马未见明显神经元损伤和胶质细胞浸润。模型组注射点附近海马齿状回背侧颗粒细胞带不完整，细胞带出现消失或者断裂，局部神经元大量缺失，并可见胶质细胞浸润。用药组注射点附近颗粒细胞带损伤程度减轻，胶质细胞浸润减少。见图1。教师职称论文发表

　　2.2  流式细胞仪检测

　　分析PI荧光直方图可发现，对照组出现典型二倍体峰，未见明显的亚二倍体峰；模型组在二倍体峰前面出现了典型的亚二倍体峰，提示有大量细胞凋亡发生；用药组的亚二倍体峰明显降低。分析结果表明，模型组海马神经细胞凋亡率较对照组显著升高(P<0.01)，而用药组海马神经细胞凋亡率较模型组显著降低(P<0.01)。见表1。表1  流式细胞仪检测细胞凋亡率(%)和TUNEL染色结果(略)

　　2.3  TUNEL染色

　　TUNEL染色阳性细胞为棕黄色，位于细胞核内，呈小圆形，环形或颗粒状。对照组大鼠海马区TUNEL染色阳性细胞数极少见；模型组海马区 TUNEL染色阳性细胞数明显增多；用药组海马区TUNEL染色阳性细胞数相对较少。分析结果表明，模型组海马区TUNEL染色阳性
细胞数较对照组大量增加（P<0.01）；而用药组海马区TUNEL染色阳性细胞数较模型组明显减少（P<0.01）。见表1，图2。

　　2.4  透射电镜

　　电镜结果显示：对照组大鼠海马神经细胞胞质内细胞器较丰富，双层核膜完整清晰，核内染色质分布较均匀。模型组大鼠海马神经细胞质内细胞器数量减少，部分胞浆空泡化，双层核膜欠清晰，核内染色质分布不均，向核膜边集，形成不规则的高电子密度团块，呈现早期凋亡征象。用药组大鼠海马神经细胞胞质内细胞器较模型组增多，空泡化变性减少，核内染色质边聚不明显。见图3。

　　2.5  免疫组织化学染色

　　细胞色素C阳性产物为棕黄色，呈颗粒状分布。对照组海马细胞色素C阳性产物数量较少，分布均匀，染色较浅；模型组海马细胞色素C阳性产物数量较对照组明显增多（P＜0.01），且出现大量集中分布现象，光密度较对照组明显增高（P＜0.01）；用药组海马细胞色素C阳性产物数量明显比模型组减少（P＜0.01），未出现大量集中分布现象，光密度也较模型组低（P＜0.01）。见表2，图4。Bcl?2阳性细胞为棕黄色，主要在胞浆着色。对照组海马Bcl?2阳性细胞数较多，染色较深；模型组海马Bcl?2阳性细胞数和平均光密度明显低于对照组（P＜0.01）；用药组海马Bcl?2阳性细胞数和平均光密度高于模型组（P＜0.01）。见表3，图5。表2  各组大鼠海马细胞色素C免疫组织化学染色结果，表3  各组大鼠海马Bcl?2免疫组化染色结果(略)。教师职称论文发表

　　3  讨论
 
　　神经细胞凋亡是AD中神经元大量丢失的主要原因之一，这个观点目前被许多学者认可,也被越来越多的实验证据所支持〔2，4〕。在AD患者的脑组织标本、动物模型、离体细胞实验中，均发现神经细胞凋亡的证据。大量的研究表明， AD病人脑组织切片中存在DNA断裂、染色质颗粒状改变和边集、细胞外形的萎缩及不规则改变等凋亡特征性变化以及凋亡相关蛋白的改变〔5〕。在家族性AD 转基因模型小鼠TgCRND8中Aβ的过量产生。会导致TGF?β1的过量表达，这反过来能够诱导Smad?7与β?连环蛋白的相互作用，导致神经细胞凋亡的发生〔6〕。Loo等〔7〕观察到Aβ可诱导培养的皮质神经细胞发生典型的凋亡特征性变化，包括膜起泡、核染色质板结、核小体DNA片段。在其他相关的研究中也显示Aβ1?40可诱导人类神经细胞发生凋亡〔8〕。本实验结果显示：模型组流式细胞仪检测海马神经细胞在直方图上G1/G0期前出现典型的亚二倍体峰；模型组海马神经细胞TUNEL染色阳性细胞数较对照组明显增多； 透射电镜观察发现模型组大鼠海马神经细胞胞质内细胞器数量减少，部分胞浆空泡化，双层核膜欠清晰，核内染色质分布不均，向核膜边集，形成不规则的高电子密度团块，呈现早期凋亡征象。本实验结果与上述文献结果一致，提示Aβ1?40可诱导大鼠海马神经细胞发生凋亡。
  
　　Aβ诱导细胞凋亡的机制涉及死亡受体路径、线粒体路径、内质网相关的凋亡诱导途径，其中线粒体路径为Aβ诱导神经细胞凋亡的主要途径〔9～11〕。研究发现,在线粒体路径中Aβ引起的神经细胞内环境的改变导致线粒体的功能损伤，下调核心抗凋亡蛋白Bcl?2，同时导致促凋亡蛋白Bax线粒体易位，最终使细胞色素C从线粒体释放入细胞质中，从而激活caspase启动凋亡级联〔9，12〕。Bcl?2是Bcl?2家族蛋白的一种，为凋亡抑制蛋白，是一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质网和核膜。Bcl?2可抑制线粒体膜电位的下降、细胞色素C的释放及caspase的激活从而抑制凋亡 。细胞色素C有控制细胞能量代谢和凋亡的双重职能，在凋亡中DNA片段化依赖于线粒体细胞色素C。细胞色素C及其氧化酶在AD中的作用已经引起许多学者的注意〔13～15〕。研究证明,Aβ损伤线粒体导致膜电位下降，膜的渗透性转换能力增加，细胞色素C从线粒体释放入胞浆中,在ATP/dATP存在的条件下与凋亡活化因子(Apaf?1)结合，提供能量诱导Apaf?1自身多聚化，形成8亚单位的Apaf?1多聚物，通过N端粘附caspase?9前体形成凋亡体复合物，其中caspase?9前体多聚化导致构象改变，自身裂解并活化，活化的caspase?9可多步骤水解反应激活caspase?3，形成级联放大反应，然后通过蛋白水解作用诱导细胞凋亡〔16〕。Clementi等〔12〕发现Aβ1?42可导致神经细胞Bax过表达，下调Bcl?2和激活caspase?3，从而导致细胞凋亡。鲍娟等〔16〕发现Aβ1?42可诱导SD大鼠神经元线粒体细胞色素C释放增加，激活线粒体凋亡途径，促使神经元凋亡，从而导致海马神经元大量丢失，出现学习记忆能力障碍。本实验免疫组织化学染色结果也证实了上述结论，模型组海马Bcl?2阳性细胞数和平均光密度低于对照组；模型组海马细胞色素C阳性产物数量和平均光密度明显高于对照组，且出现大量集中分布现象。本实验结果提示，Aβ1?40可下调大鼠海马神经细胞Bcl?2蛋白的表达，促使细胞色素C的释放，激活线粒体凋亡途径，促使神经细胞凋亡。
　  
　　TP为卫矛科植物雷公藤中分离出来的一种单体,具有较强的抗炎、免疫抑制作用。TP 可以有效地拮抗H2O2对PC12 细胞的氧化损伤，作用机制可能与其降低转录因子NF?κB 的转录活性有关〔17〕。我室前期工作证明，TP可能通过对大鼠核因子NF?κB活化的抑制作用，减轻AD模型大鼠脑内的免疫炎症反应，改善AD大鼠的学习记忆能力〔3〕。本实验甲苯胺蓝染色显示用药组SD大鼠海马神经细胞损伤程度减轻；流式细胞仪检测结果显示，用药组海马神经细胞凋亡率明显低于模型组；TUNEL染色结果显示，用药组海马神经细胞TUNEL染色阳性细胞数较模型组明显减少；透射电镜结果显示，用药组大鼠海马神经细胞胞质内细胞器较模型组增多，空泡化变性减少，核内染色质边聚不明显。本实验结果提示TP
可抑制AD模型大鼠海马神经细胞的凋亡。
  
　　TP 抑制AD模型大鼠海马神经细胞凋亡的机制目前还不清楚。本实验免疫组织化学染色结果显示，用药组大鼠海马Bcl?2阳性细胞数和平均光密度明显高于模型组，用药组大鼠海马细胞色素C阳性产物数和平均光密度较模型组明显减少。提示，TP抗凋亡作用的机制可能与促进海马神经细胞Bcl?2蛋白的表达，稳定线粒体膜功能，减少细胞色素C的释放有关。

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