碰柑胚乳三倍体愈伤组织的诱导研究
1 ，聂振朋 2 ，柯甫志 2 /1. 台州科技职业学院 农业与生物工程学院园艺植物研究所，2. 浙江省柑桔研究所摘 要：为了对碰柑胚乳培养获得三倍体愈伤组织，本文设不同的时间梯度对碰柑果实进行 0 ～ 4℃低温预处理，筛选最佳处理时间。然后对 2,4-D 设不同的浓度梯度，以 MS 培养基，对碰柑的胚乳进行愈伤组织的诱导。结果表明：0 ～ 4℃处理碰柑果实 5 天，碰柑愈伤组织的诱导率达到最高，继续延长处理时间，诱导率会下降；用 0 ～ 4℃处理 5 天后碰柑果实胚乳做材料，以 MS 培养基，当 2,4-D 浓度为 0.2mg/L 时，碰柑乳愈伤组织的诱导效果好，随着 2,4-D 浓度升高，对碰柑乳愈伤组织诱导反而有一定的抑制作用。
关键词：碰柑；胚乳；诱导
无核果实通常是指果实没有种子、只有少量败育种子或种子数量比正常品种少的果实。无核是优质柑桔果实非常重要的一个园艺性状，柑桔果实是否无核严重影响该柑桔果实的受欢迎程度。碰柑又叫芦柑、太柑。果实扁圆形，果面橙黄色或橙色，皮薄易剥，果肉脆嫩，甜浓爽口，色泽鲜美，汁多化渣爽口，且有药用功效。又由于其贮藏性好，深受广大消费者的喜爱。我国是椪柑的原产地和主产国 , 面积和产量均占世界椪柑面积和产量的前列。同时，椪柑也是浙江省果业的重要组成部分。但是，碰柑果实中有种子，影响了碰柑的商品价值。
柑桔胚乳组织培养是是获得无籽柑桔的重要途径。因为，胚乳是双受精产物之一，由 1 个精核和 2 个极核融合而成，是三倍体组织。由胚乳培养产生的再生植株通常也是三倍体，可产生无子果实。因此，本文以碰柑胚乳为材料，研究柑桔胚乳三倍体植株的诱导，以期获得碰柑无核的三倍体胚乳再生植株。
一、材料与方法
1．试验材料
碰柑果实取自台州科技职业学院果园，以果龄 2 个月左右的柑桔幼果为宜。
2. 试验方法
2.1 幼果低温处理
采用0～4℃低温进行碰柑幼果的预处理，通过1天、3天、5 天、7 天不同的处理时间梯度，探索不同低温处理时间对碰柑胚乳愈伤组织诱导的影响。每个处理 6 瓶，每瓶接 10 个愈伤块。及时观察形态，50d 后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率 = 愈伤组织块数／接种个数。
2.2 取胚乳
把低温预处理好的的碰柑幼果用流水冲洗 30min 左右，然后剥离出种子，再把种子用 0.1％ HgCl2 消毒 5min 左右。
去除种子后，用无菌水冲洗 4—5 次，每次 5min 左右。在无菌条件下，把碰柑种子的合点端纵剖一刀，打开种子取出胚囊。
然后再轻轻挤压胚囊的胚端，挤出幼胚，剥离出胚乳。选择半透明状固体、富有弹性的胚乳，单独接种。
2.3 愈伤组织诱导
2,4-D 在很多植物中具有促进愈伤组织形成的作用，椪柑胚乳愈伤诱导试验将经过 1.2.1 筛选出低温预处理时间的柑橘胚乳接种在含有 2,4-D 浓度不同的培养基上。在愈伤诱导过程中，分析不同浓度 2,4-D 对胚乳愈伤形成的影响，筛选出最佳的诱导愈伤培养基 2,4-D 浓度值。
培养基为：ＭＳ+6-BA 1.0mg／L+sucrose40g／L。2,4-D浓度设 0.2mg/L、 0.4mg/L、0.6mg/L 三个梯度。将灭菌后的胚乳置于无菌的培养皿中。每瓶接 10 个，处理 3 瓶。及时观察形态，50d 后统计愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率 = 愈伤组织块数／接种个数。
二、实验结果
1. 低温预处理：
本试验结果表明：处理 1 天，愈伤组织诱导率为 3.33%；处理 3 天，愈伤组织的诱导率为 5.00%；处理 5 天，愈伤组织的诱导率达到 8.33%；处理 7 天，愈伤组织的诱导率降低为 5.00%。椪柑低温预处理时间以 5 天，愈伤组织的诱导率最高（见表 1）。
表 1 低温预处理对胚乳愈伤组织诱导的影响
2. 愈伤组织诱导
本试验结果表明：当 2,4-D 浓度 0.2mg/L 时，3 个处理形成的愈伤组织块数分别为 2 个、2 个、3 个，愈伤组织诱导率分别为 20%、20%、30%；当 2,4-D 浓度 0.4mg/L 时，3 个处理形成的愈伤组织块数分别为 0 个、1 个、1 个，愈伤组织诱导率分别为 0、10%、10%；当 2,4-D 浓度 0.6mg/L 时，形成的愈伤组织块数分别为 1 个、0 个、0 个，愈伤组织诱导率分别为 10%、0、0%;2,4-D 浓度 0.2mg/L 时，形成的愈伤组织块数最多，诱导率最高（见表 2）。
表 2 不同 2,4-D 浓度对愈伤组织诱导的影响
三、结论与讨论
植物胚乳培养中，愈伤组织的诱导与形成通常是外部培养条件和植物体内部环境共同起作用。不同低温预处理时间对碰柑乳愈伤组织的诱导的效果不同，处理 1 天，愈伤组织诱导率为 3.33%，处理 5 天，愈伤组织的诱导率达到 8.33%。
说明适当延长低温预处理时间在一定程度上可以提高碰柑胚乳愈伤组织的诱导。而处理 5 天，愈伤组织的诱导率最高，而处理 7 天，愈伤组织的诱导率由 8.33% 下降到 5.00%，说明低温处理时间过长其诱导效应反而会降低。
在植物组织培养中，植物体内源激素的水平，对愈伤组织的诱导成。不同植物生长调节剂的比例和浓度的变化，会影响愈伤组织分化和形成的过程。6-BA 对碰柑愈伤组织的诱导也有影响，本实验是在6-BA浓度不变的情况下，探讨2,4-D不同浓度梯度对碰柑愈伤组织的诱导效果。本次实验表明浓度为 0.2mg/L 的 2,4-D 对碰柑乳愈伤组织诱导效果比较好，随着 2,4-D 浓度升高，对碰柑乳愈伤组织诱导反而有一定的抑制作用。
参考文献：
[1] 肖金平．柑桔无核机理与无核性状分子标记研究 [D]．浙江大学博士学位论．2007:1．[2] 沈德绪，王元裕，陈力耕．柑桔遗传育种学 [M]．北京 ：
科学出版社 ，1998 ：154—158 ，284—287．[3] 李海林，聂振朋， 柯甫志．柑桔胚乳培养体系的建立与优化 [J]．现代园艺，2019（7):9-10．作者简介：李海林（1979—），男，甘肃陇南人，硕士，工程师，讲师，主要从事与园艺植物相关的教学与科研工作。
本文系浙江省教育厅 2017 年度高校访问工程师“校企合作项目”柑桔果实无核育种研究（课题编号：FG2017203）研究成果
