低氧诱导因子?1与肝癌的研究现状
【摘要】 低氧诱导因子?1(HIF?1)是由两个亚基组成的异源二聚体体蛋白，其活性主要是由a亚基的稳定性来调节。它在低氧条件下被激活，特异性地与靶基因的低氧反应元件结合，并诱导靶基因转录，提高肿瘤细胞的低氧适应能力，利于其生长、增殖、转移。其机制包括促进肿瘤干细胞的分化，调节肿瘤细胞的代谢，促进肿瘤新生血管形成，抗肿瘤细胞凋亡等。近年有许多关于HIF?1与肝癌及肝癌细胞的研究，本文综述了其与肝癌发生、发展和治疗的研究现状。教师职称论文发表
【关键词】 低氧诱导因子?1;肝癌;肝癌细胞;综述文献
氧是机体新陈代谢和维持生存的必备要素，是细胞生命活动的基本前期。实体瘤生长到一定程度时，肿瘤对氧和营养物质的消耗超过供给，可导致肿瘤微环境呈现低氧、低糖和低酸[1]，而肿瘤的快速细胞分裂和异常血管结构导致出现严重氧缺乏(低氧)部位，低氧诱导肿瘤细胞产生低氧诱导因子(HIFs),现就 HIF与肝癌、肝癌细胞的研究现状作一综述如下。
1 HIF
1.1 结构
HIF?1是Semenza等[2]于1992年发现的，他们在低氧的肝细胞癌细胞株Hep 3B细胞的提取物中发现的一种蛋白，其能特异性地结合促红细胞生成素(EPO)基因增强的寡核苷酸序列，命名为HIF?1。通过纯化发现其为两个亚单位组成的异源二聚体，一个是120kD的a亚单位和一个是91/93/94kD的B亚单位，两者均为真核细胞转录因子bHLH(碱性螺旋环螺旋)?PAS(PER、ARNT、SIM)蛋白家族成员。a和B亚基均包含bHLH结构域、PAS结构域、羧基末端的反式活化结构域及入核信号。bHLH 中的碱性区域介导与DNA结合，bHLH和PAS结构域则共同提供亚基之间蛋白二聚化的功能界面。序列同源性a亚基目前认为是调节HIF活化的功能亚单位，而B亚基属于构建型表达，不受O2调节和影响。人类的HIF?1a的基因定位于14号染色体(14q21?24), a亚单位全长826个氨基酸，其中300氨基酸为DNA最适宜结合所必须，1～166氨基酸介导其与HIF?1B的异二聚体化。羧基端氨基酸 (391～826)包含两个反式活化结构域，二者被抑制结构域分开。当HIF?a与HIF?1B形成二聚体时反式活化结构域才起作用。
1.2 功能
HIF是转录因子，对哺乳动物细胞中氧的稳定起重要作用，能通过刺激促红细胞生成素(EPO)和VEGF等的基因转录。而其转录产物可以通过促使红细胞生成和血管生成来增加氧的获得，也可以激活参与的葡萄糖的转用和代谢的酶基因表达，使细胞适应低氧微环境。此现象在肿瘤细胞尤其明显，不依赖低氧的基础表达的HIF?1a即能诱导靶基因转录[3]，HIF?1还能反式作用于抗增殖基因和促凋亡基因(例如NIX、BNIP3及IGFBP3)，以利于肿瘤的生长[4]。
1.3 调节机制和信号通路教师职称论文发表
在正常条件下HIF?1a的调节是氧依赖的降解过程。Maxwell等[5]首先证实肿瘤抑制蛋白VHL(Von Hippel?Lindau tumour suppressor protein，pVHL)结合， pVHL具有E3泛素化蛋白酶活性，pVHL与HIF?1a一旦结合就会募集Elongin B、C、Cullin2(cul2)和RBX1形成功能性的E3泛素?蛋白酶复合体，泛素化的HIF?1a立即被265蛋白酶复合体结合并降解。该过程中的羟基化的完成依赖于环境中O2的参与。另外人HIF?1a的803位点存在天冬酰胺，在Fe2+与O2的参与下，HIF抑制因子可以将该天冬酰胺羟基化，从而阻止HIF?1a与转录辅激活因子P300结合，导致HIF?1转录活性丧失[6]。而在低氧条件下HIF?1与其下游的基因(如VEGF、 p53和EPO等)结合发挥作用。
HIF与多种基因和蛋白相关。(1)与p53的关系：Carmeliet等[7]证发现缺氧条件下野生型胚胎干细胞的p53蛋白水平升高，在 HIF?1a基因缺失的胚胎干细胞中p53蛋白水平则没有明显改变，从而认为缺氧时p53蛋白水平的升高是呈HIF?1依赖的。而去磷酸化的HIF?1同 p53的诱导有密切关系，是同p53结合的主要形式，在p53的稳定剂p53依赖性细胞凋亡途径中发挥重要作用[8]。(2)与热休克蛋白(heat shock protain，Hsp)的关系：Hsp90可直接与HIF?1a作用，并能促进其构想改变以利于二聚体形成，具有稳定HIF?1的作用。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂作用于Hsp70/Hp90轴，诱导HIF?1a非泛素依赖的途径降解[9]。(3)与磷脂酰肌醇(?3)激酶P13K/AKT的关系：P13K可以通过刺激Hsp的表达而稳定HIF?1[10]。Mottet等[11]发现在低氧条件下，依赖活性的P13K/AKT可以使缺氧早期细胞内HIF?1a含量增加，性质稳定。(4)与乙肝病毒X蛋白(HBVx)的关系：Moon等[12]证实HBVx能促使HIF?1a积累，增加其稳定和转录活性。(5)与坏血酸的关系：Knowles等[13]研究发现坏血酸能抑制氯化钴和去铁敏诱导的HIF?1a表达并降低其转录活性，但对严重乏氧诱导的HIF?1a表达几乎无影响。(6)HIF?1可诱发致凋亡蛋白如BNIP3的高度聚集，BNIP3启动子包括一个HRE,HIF?1可诱导该基因表达。实验表明，在大鼠成纤维细胞和乳腺癌细胞MCF7中，缺乏HIF?1的细胞无大量BNIP3聚集，凋亡率也降低。
在肿瘤坏死周边区域，促凋亡蛋白BNIP3(BCL2/adenovirus EIB19 kDa interacting protein 3)和NIX(BNIP3类似物)在转录水平表达增加。缺氧可以上调BNIP3在肿瘤细胞系、上皮细胞和巨噬细胞中的表达，过表达的BNIP3可以结合抗凋亡蛋白Bal?2和Bcl?xL并抑制它们的保护作用。BNIP3的启动子含有低氧反应元件(HRE)，HIF?1a可以诱导次基因转录。
总之，HIF在低氧条件下激活后，转录调节相应的下游基因，包括血管生成、能量代谢、红细胞生成、诱导或阻止细胞凋亡、刺激细胞增生等。
2 HIFs与肿瘤
缺氧是实体肿瘤常见的现象，肿瘤形成过程关键是肿瘤细胞对缺氧的适应。而HIFs在这一过程中起着中枢纽带作用。Talks等[14]利用免疫组化方法检测了HIF?1在多种组织中的表达，结果显示，HIF?1在膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌中均有高表达。而研究[15?17]表明：大量肿瘤抑制基因的失活(如pVHL、PTEN和p53)，多种肿瘤基因的激活(如Ha?ras、cMyc)及不同生长因子通路的激活(如表皮生长因子、胰岛素、IGF?1、IGF?2、血管紧张素2、血栓素及PDGF)均可诱导HIF?1的活化。由于HIF在肿瘤组织中的表达上调及HIF?1对血管生长和肿瘤生长的作用，可以推测如果HIF通路阻断就可以降低血管生成和肿瘤生长，此已由Moon等[12]在小鼠肝癌细胞和胚胎干细胞的实验中证实。
Krishnamachary等[18]研究发现HIF?1a可刺激人结肠癌HCT116细胞浸润人工三线基底膜(Matrigel)、诱导组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶2(MMP2)等多种与肿瘤侵袭和转移相关的因子和水解酶类的表达，促进肿瘤细胞粘附，降解细胞外基质和肿瘤细胞迁移。
教师职称论文发表
非侵袭性乳腺癌中HIF?1的过表达与细胞增殖密切相关;口腔鳞状细胞癌HIF?1的过表达也与细胞的增殖相关;肺癌中HIF?1过表达与凋亡关系密切 。有研究报道，表达HIF?1a的肿瘤生长不但没有延迟，反而加速，这可能是低氧诱导的凋亡减少而应激诱导的增殖增加[19] 。
3 HIFs与肝癌
3.1 HIF?1与肝癌细胞增殖、凋亡的关系
肝癌是实体瘤的一种，和其它实体肿瘤一样存在着缺氧现象，而肿瘤的形成、肿瘤细胞的增殖分化的关键一步是对缺氧的适应，这个适应过程是通过形成多血管体系和提高糖酵解速率来完成的，通常情况，缺氧存在能使肿瘤细胞的一些基因和蛋白表达变化发生变化，如氧调节蛋白(oxygen regulated proteins,ORPs)、VEGF、促红细胞生成素(EPO)、P53和血小板源性生长因子B等[20?21]。肝癌细胞的能量供应主要通过糖酵解实现的。肝癌细胞在氧缺乏的状态通过下列途径获取能量：(1)磷酸甘油激酶1(PGK1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)，分析低氧处理的各种鼠肝癌细胞株和人肝癌细胞株发现，PGK1和PKM2mRNA均有一定增加而HIF?1amRNA并没变化，进一步分析HIF?1可激活转录糖酵解途径的关键酶 PGK1和PKM2mRNA。(2)HIF?1a诱导己糖激酶2表达，糖酵解加强[22]。(3)磷酸果糖激酶/果糖?2，6?二磷酸酶(PFK?2 /FBPaswe?2)为同工酶，低氧时HIFs可明显提高肝癌细胞内PFKFB4mRNA水平，导致PFK?2/FBPaswe?2含量增加[23]，导致糖酵解的加快。能量供给的增加有利于肝癌细胞的增殖，而且在低氧条件下HIF?1a可以诱导己糖激酶2表达，从而促进肝癌细胞的增殖。有研究报道 HIF?1a具有潜在的抗凋亡作用从而促进肝癌细胞的生长和肝癌的发生，肝癌细胞在缺氧低于4h的情况下，HIF?1a和Bcl?2随着缺氧程度的的增加表达逐渐升高，而Caspase?3的表达却相反,表明HIF?1a表达与与肝癌细胞的凋亡抑制有关[24]。
3.2 HIF?1与肝癌血管的关系
肝癌细胞的不断增殖生长和肝癌的发展离不开肝癌新生的血管运送氧和营养。HIF?1a作为一种转录因子存在于肝癌细胞中，是VEGF基因上游重要表达调控因子。实验证实HIF?1a不仅可促进VEGF的转录而且可以增加VEGFmRNA的稳定性。Moon等[12]用HBx转基因小鼠模型研究发现，与非新生物区肝组织比较，新生物病损区HIF?1a和 VEGF明显增加VEGF的过度表达可促进大量微血管的形成。此外，HIF?1a在低氧条件下还可以通过调节血管生成因子Ang?1和Ang4来诱导血管生成[25]。
研究还发现，HIF?1a在大多数肿瘤组织中的表达与肿瘤的浸润、转移和预后密切相关[26?27]。
3.3 HIF?1与肝癌的治疗
由于HIF?1在肝癌形成和肝癌血管形成中的作用，因此可以通过HIF?1a的稳定和降解，或者调节其活性来发挥抗肿瘤作用。2?甲氧雌二醇 (2ME2)是个新的抗肿瘤和抗血管生成物质，它能在破坏肿瘤细胞微管的浓度下抑制肿瘤生长和血管生成，在转录后水平下调HIF?1表达，并抑制 HIF?1诱导的VEGF的基因转录[28]。血管的形成是实体瘤的浸润、转移所必需的，因而在这方面的研究也受到了重视，Yeo等[29]用YC?1处理小白鼠，发现HIF?1a的活性被抑制，结果肿瘤血管生成中断，肿瘤生长受抑制。
4 结语
HIF?1在多种恶性肿瘤细胞中表达均高于正常组织细胞，且在肿瘤细胞的增殖肿瘤的生长浸润、转移等过程起着重要作用;而且针对于HIF?1的研究也越来越多，一些研究者认为针对设计的新抗癌药物可能对肝癌以及其他肿瘤的治疗带来新的希望，因此，对HIF?1的深入认识以及了解其与肝癌的关系将更有利于肝癌的治疗，提高肝癌患者的生存率。
【参考文献】教师职称论文发表
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1 HIF
1.1 结构
HIF?1是Semenza等[2]于1992年发现的，他们在低氧的肝细胞癌细胞株Hep 3B细胞的提取物中发现的一种蛋白，其能特异性地结合促红细胞生成素(EPO)基因增强的寡核苷酸序列，命名为HIF?1。通过纯化发现其为两个亚单位组成的异源二聚体，一个是120kD的a亚单位和一个是91/93/94kD的B亚单位，两者均为真核细胞转录因子bHLH(碱性螺旋环螺旋)?PAS(PER、ARNT、SIM)蛋白家族成员。a和B亚基均包含bHLH结构域、PAS结构域、羧基末端的反式活化结构域及入核信号。bHLH 中的碱性区域介导与DNA结合，bHLH和PAS结构域则共同提供亚基之间蛋白二聚化的功能界面。序列同源性a亚基目前认为是调节HIF活化的功能亚单位，而B亚基属于构建型表达，不受O2调节和影响。人类的HIF?1a的基因定位于14号染色体(14q21?24), a亚单位全长826个氨基酸，其中300氨基酸为DNA最适宜结合所必须，1～166氨基酸介导其与HIF?1B的异二聚体化。羧基端氨基酸 (391～826)包含两个反式活化结构域，二者被抑制结构域分开。当HIF?a与HIF?1B形成二聚体时反式活化结构域才起作用。
1.2 功能
HIF是转录因子，对哺乳动物细胞中氧的稳定起重要作用，能通过刺激促红细胞生成素(EPO)和VEGF等的基因转录。而其转录产物可以通过促使红细胞生成和血管生成来增加氧的获得，也可以激活参与的葡萄糖的转用和代谢的酶基因表达，使细胞适应低氧微环境。此现象在肿瘤细胞尤其明显，不依赖低氧的基础表达的HIF?1a即能诱导靶基因转录[3]，HIF?1还能反式作用于抗增殖基因和促凋亡基因(例如NIX、BNIP3及IGFBP3)，以利于肿瘤的生长[4]。
1.3 调节机制和信号通路教师职称论文发表
在正常条件下HIF?1a的调节是氧依赖的降解过程。Maxwell等[5]首先证实肿瘤抑制蛋白VHL(Von Hippel?Lindau tumour suppressor protein，pVHL)结合， pVHL具有E3泛素化蛋白酶活性，pVHL与HIF?1a一旦结合就会募集Elongin B、C、Cullin2(cul2)和RBX1形成功能性的E3泛素?蛋白酶复合体，泛素化的HIF?1a立即被265蛋白酶复合体结合并降解。该过程中的羟基化的完成依赖于环境中O2的参与。另外人HIF?1a的803位点存在天冬酰胺，在Fe2+与O2的参与下，HIF抑制因子可以将该天冬酰胺羟基化，从而阻止HIF?1a与转录辅激活因子P300结合，导致HIF?1转录活性丧失[6]。而在低氧条件下HIF?1与其下游的基因(如VEGF、 p53和EPO等)结合发挥作用。
HIF与多种基因和蛋白相关。(1)与p53的关系：Carmeliet等[7]证发现缺氧条件下野生型胚胎干细胞的p53蛋白水平升高，在 HIF?1a基因缺失的胚胎干细胞中p53蛋白水平则没有明显改变，从而认为缺氧时p53蛋白水平的升高是呈HIF?1依赖的。而去磷酸化的HIF?1同 p53的诱导有密切关系，是同p53结合的主要形式，在p53的稳定剂p53依赖性细胞凋亡途径中发挥重要作用[8]。(2)与热休克蛋白(heat shock protain，Hsp)的关系：Hsp90可直接与HIF?1a作用，并能促进其构想改变以利于二聚体形成，具有稳定HIF?1的作用。组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂作用于Hsp70/Hp90轴，诱导HIF?1a非泛素依赖的途径降解[9]。(3)与磷脂酰肌醇(?3)激酶P13K/AKT的关系：P13K可以通过刺激Hsp的表达而稳定HIF?1[10]。Mottet等[11]发现在低氧条件下，依赖活性的P13K/AKT可以使缺氧早期细胞内HIF?1a含量增加，性质稳定。(4)与乙肝病毒X蛋白(HBVx)的关系：Moon等[12]证实HBVx能促使HIF?1a积累，增加其稳定和转录活性。(5)与坏血酸的关系：Knowles等[13]研究发现坏血酸能抑制氯化钴和去铁敏诱导的HIF?1a表达并降低其转录活性，但对严重乏氧诱导的HIF?1a表达几乎无影响。(6)HIF?1可诱发致凋亡蛋白如BNIP3的高度聚集，BNIP3启动子包括一个HRE,HIF?1可诱导该基因表达。实验表明，在大鼠成纤维细胞和乳腺癌细胞MCF7中，缺乏HIF?1的细胞无大量BNIP3聚集，凋亡率也降低。
在肿瘤坏死周边区域，促凋亡蛋白BNIP3(BCL2/adenovirus EIB19 kDa interacting protein 3)和NIX(BNIP3类似物)在转录水平表达增加。缺氧可以上调BNIP3在肿瘤细胞系、上皮细胞和巨噬细胞中的表达，过表达的BNIP3可以结合抗凋亡蛋白Bal?2和Bcl?xL并抑制它们的保护作用。BNIP3的启动子含有低氧反应元件(HRE)，HIF?1a可以诱导次基因转录。
总之，HIF在低氧条件下激活后，转录调节相应的下游基因，包括血管生成、能量代谢、红细胞生成、诱导或阻止细胞凋亡、刺激细胞增生等。
2 HIFs与肿瘤
缺氧是实体肿瘤常见的现象，肿瘤形成过程关键是肿瘤细胞对缺氧的适应。而HIFs在这一过程中起着中枢纽带作用。Talks等[14]利用免疫组化方法检测了HIF?1在多种组织中的表达，结果显示，HIF?1在膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和肾癌中均有高表达。而研究[15?17]表明：大量肿瘤抑制基因的失活(如pVHL、PTEN和p53)，多种肿瘤基因的激活(如Ha?ras、cMyc)及不同生长因子通路的激活(如表皮生长因子、胰岛素、IGF?1、IGF?2、血管紧张素2、血栓素及PDGF)均可诱导HIF?1的活化。由于HIF在肿瘤组织中的表达上调及HIF?1对血管生长和肿瘤生长的作用，可以推测如果HIF通路阻断就可以降低血管生成和肿瘤生长，此已由Moon等[12]在小鼠肝癌细胞和胚胎干细胞的实验中证实。
Krishnamachary等[18]研究发现HIF?1a可刺激人结肠癌HCT116细胞浸润人工三线基底膜(Matrigel)、诱导组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶2(MMP2)等多种与肿瘤侵袭和转移相关的因子和水解酶类的表达，促进肿瘤细胞粘附，降解细胞外基质和肿瘤细胞迁移。
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非侵袭性乳腺癌中HIF?1的过表达与细胞增殖密切相关;口腔鳞状细胞癌HIF?1的过表达也与细胞的增殖相关;肺癌中HIF?1过表达与凋亡关系密切 。有研究报道，表达HIF?1a的肿瘤生长不但没有延迟，反而加速，这可能是低氧诱导的凋亡减少而应激诱导的增殖增加[19] 。
3 HIFs与肝癌
3.1 HIF?1与肝癌细胞增殖、凋亡的关系
肝癌是实体瘤的一种，和其它实体肿瘤一样存在着缺氧现象，而肿瘤的形成、肿瘤细胞的增殖分化的关键一步是对缺氧的适应，这个适应过程是通过形成多血管体系和提高糖酵解速率来完成的，通常情况，缺氧存在能使肿瘤细胞的一些基因和蛋白表达变化发生变化，如氧调节蛋白(oxygen regulated proteins,ORPs)、VEGF、促红细胞生成素(EPO)、P53和血小板源性生长因子B等[20?21]。肝癌细胞的能量供应主要通过糖酵解实现的。肝癌细胞在氧缺乏的状态通过下列途径获取能量：(1)磷酸甘油激酶1(PGK1)和丙酮酸激酶M2(PKM2)，分析低氧处理的各种鼠肝癌细胞株和人肝癌细胞株发现，PGK1和PKM2mRNA均有一定增加而HIF?1amRNA并没变化，进一步分析HIF?1可激活转录糖酵解途径的关键酶 PGK1和PKM2mRNA。(2)HIF?1a诱导己糖激酶2表达，糖酵解加强[22]。(3)磷酸果糖激酶/果糖?2，6?二磷酸酶(PFK?2 /FBPaswe?2)为同工酶，低氧时HIFs可明显提高肝癌细胞内PFKFB4mRNA水平，导致PFK?2/FBPaswe?2含量增加[23]，导致糖酵解的加快。能量供给的增加有利于肝癌细胞的增殖，而且在低氧条件下HIF?1a可以诱导己糖激酶2表达，从而促进肝癌细胞的增殖。有研究报道 HIF?1a具有潜在的抗凋亡作用从而促进肝癌细胞的生长和肝癌的发生，肝癌细胞在缺氧低于4h的情况下，HIF?1a和Bcl?2随着缺氧程度的的增加表达逐渐升高，而Caspase?3的表达却相反,表明HIF?1a表达与与肝癌细胞的凋亡抑制有关[24]。
3.2 HIF?1与肝癌血管的关系
肝癌细胞的不断增殖生长和肝癌的发展离不开肝癌新生的血管运送氧和营养。HIF?1a作为一种转录因子存在于肝癌细胞中，是VEGF基因上游重要表达调控因子。实验证实HIF?1a不仅可促进VEGF的转录而且可以增加VEGFmRNA的稳定性。Moon等[12]用HBx转基因小鼠模型研究发现，与非新生物区肝组织比较，新生物病损区HIF?1a和 VEGF明显增加VEGF的过度表达可促进大量微血管的形成。此外，HIF?1a在低氧条件下还可以通过调节血管生成因子Ang?1和Ang4来诱导血管生成[25]。
研究还发现，HIF?1a在大多数肿瘤组织中的表达与肿瘤的浸润、转移和预后密切相关[26?27]。
3.3 HIF?1与肝癌的治疗
由于HIF?1在肝癌形成和肝癌血管形成中的作用，因此可以通过HIF?1a的稳定和降解，或者调节其活性来发挥抗肿瘤作用。2?甲氧雌二醇 (2ME2)是个新的抗肿瘤和抗血管生成物质，它能在破坏肿瘤细胞微管的浓度下抑制肿瘤生长和血管生成，在转录后水平下调HIF?1表达，并抑制 HIF?1诱导的VEGF的基因转录[28]。血管的形成是实体瘤的浸润、转移所必需的，因而在这方面的研究也受到了重视，Yeo等[29]用YC?1处理小白鼠，发现HIF?1a的活性被抑制，结果肿瘤血管生成中断，肿瘤生长受抑制。
4 结语
HIF?1在多种恶性肿瘤细胞中表达均高于正常组织细胞，且在肿瘤细胞的增殖肿瘤的生长浸润、转移等过程起着重要作用;而且针对于HIF?1的研究也越来越多，一些研究者认为针对设计的新抗癌药物可能对肝癌以及其他肿瘤的治疗带来新的希望，因此，对HIF?1的深入认识以及了解其与肝癌的关系将更有利于肝癌的治疗，提高肝癌患者的生存率。
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