高效液相色谱法测定术后饮中橙皮苷的含量
【摘要】 目的 建立术后饮中橙皮苷含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79),流速为0.8 mL/min,检测波长为284 nm,柱温为室温,进样量为20 μL。结果 橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好,平均回收率为98.59%,RSD＝0.72%。结论 方法简便、准确、重复性好,可作为术后饮中橙皮苷的含量测定方法。
学术论文发表
【关键词】 高效液相色谱法；术后饮；橙皮苷；含量测定
Key words：HPLC；Shuhouyin；hesperidin；content determination
术后饮系甘肃武威肿瘤医院研制的医院制剂,是由太子参、白花蛇舌草、陈皮、甘草等药味制成的合剂,具有补气理气、行气宽中、降逆下气的功能,用于手术后气血亏虚所致的腑气不通诸症的治疗。经过临床多年使用,疗效显著。为控制其质量,参考文献[1-6],采用高效液相色谱(HPLC)法对方中君药陈皮的主要有效成分橙皮苷进行了含量测定,结果方法简便、准确、重复性好,为术后饮质量标准的研究与指标的制定提供了试验依据。
1 仪器与试药
SSI PC-2000型高效液相色谱仪,Model500紫外检测器,7725i手动进样阀,分析之星色谱工作站；XT120A电子分析天平(瑞士普利赛斯)；HS10260D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。
橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110721-200512,供含量测定用)；术后饮样品及缺陈皮的阴性对照样品均由甘肃武威肿瘤医院提供(批号060810,060812, 060815)。水为重蒸馏水,乙腈为色谱纯,聚酰胺为层析用试剂(80～100目),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连江申分离科学技术公司)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速：0.8 mL/min；检测波长：284 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。在上述色谱条件下,橙皮苷与相邻峰达到基线分离,且阴性对照无干扰,峰形对称,分离效果良好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品25.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,然后用甲醇溶解至刻度,摇匀,配成浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液,精密吸取2 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备学术论文发表
精密量取本品10 mL,置具塞锥形瓶中,加硅藻土5 g,搅拌均匀,烘干,精密加入甲醇120 mL,称定重量,充分搅拌,超声40 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液100 mL置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣用70%乙醇100 mL使溶解并转移至分液漏斗中,加石油醚(60～90 ℃)萃取3次(50、30、20 mL),弃去石油醚液,分取70%乙醇液置蒸发皿中,蒸去乙醇,剩余水液上聚酰胺层析柱(1 cm×25 cm层析柱,称聚酰胺1.8 g,湿法装柱),先用20 mL水冲洗(6 mL/min),再加入70 mL甲醇冲洗,收集甲醇液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系考察
精密吸取上述橙皮苷浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下分别进样20 μL,测定。以峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程为：A＝27 248 838.6C＋91 201.7,r＝0.999 7。表明橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μL,重复进样5次,计算5次峰面积的RSD＝0.83%。
2.6 稳定性试验
取室温放置的对照品溶液,在上述色谱条件下,于0、1、2、4、8、24 h分别进样20 μL,测定峰面积的RSD＝0.71%,表明橙皮苷甲醇溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
精密量取供试品(批号060812)10 mL各5份,按“样品测定”项下操作,计算含量,结果分别为0.216 1、0.214 9、0.218 1、0.218 5、0.217 1 ㎎/mL,平均含量为0.216 9 mg/mL,RSD＝0.94%。
【摘要】 目的 建立术后饮中橙皮苷含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79),流速为0.8 mL/min,检测波长为284 nm,柱温为室温,进样量为20 μL。结果 橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好,平均回收率为98.59%,RSD＝0.72%。结论 方法简便、准确、重复性好,可作为术后饮中橙皮苷的含量测定方法。
学术论文发表
【关键词】 高效液相色谱法；术后饮；橙皮苷；含量测定
Content Determination of Hesperidin in Shuhouyin by HPLC WANG Gang, ZHAO Liang-cun1.Wuwei Institute for Drug Control, Wuwei 733000, China；2.Gansu Wuwei Cancer Hospital, Wuwei 733000, China Abstract：Objective To establish a HPLC method for the content determination of hesperidin in Shuhouyin. Methods Chromatographic assay was performed on CenturySIL C18-AQ (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column at room temperature. The mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (21∶79). The flow rate was 0.8 mL/min. The detection wavelength was at 284 nm. The sample size was 20 μL. Results Good linear relationship of hesperidin achieved in the range of 1.004～10.04 μg. The average recovery rate was 98.59% with RSD＝0.72%. Conclusion The method is simple, accurate and stable with good reproducibility. This method can be used for determination of hesperidin in Shuhouyin.
Key words：HPLC；Shuhouyin；hesperidin；content determination
术后饮系甘肃武威肿瘤医院研制的医院制剂,是由太子参、白花蛇舌草、陈皮、甘草等药味制成的合剂,具有补气理气、行气宽中、降逆下气的功能,用于手术后气血亏虚所致的腑气不通诸症的治疗。经过临床多年使用,疗效显著。为控制其质量,参考文献[1-6],采用高效液相色谱(HPLC)法对方中君药陈皮的主要有效成分橙皮苷进行了含量测定,结果方法简便、准确、重复性好,为术后饮质量标准的研究与指标的制定提供了试验依据。
1 仪器与试药
SSI PC-2000型高效液相色谱仪,Model500紫外检测器,7725i手动进样阀,分析之星色谱工作站；XT120A电子分析天平(瑞士普利赛斯)；HS10260D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。
橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110721-200512,供含量测定用)；术后饮样品及缺陈皮的阴性对照样品均由甘肃武威肿瘤医院提供(批号060810,060812, 060815)。水为重蒸馏水,乙腈为色谱纯,聚酰胺为层析用试剂(80～100目),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果学术论文发表
2.1 色谱条件
色谱柱：CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连江申分离科学技术公司)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速：0.8 mL/min；检测波长：284 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。在上述色谱条件下,橙皮苷与相邻峰达到基线分离,且阴性对照无干扰,峰形对称,分离效果良好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品25.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,然后用甲醇溶解至刻度,摇匀,配成浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液,精密吸取2 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品10 mL,置具塞锥形瓶中,加硅藻土5 g,搅拌均匀,烘干,精密加入甲醇120 mL,称定重量,充分搅拌,超声40 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液100 mL置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣用70%乙醇100 mL使溶解并转移至分液漏斗中,加石油醚(60～90 ℃)萃取3次(50、30、20 mL),弃去石油醚液,分取70%乙醇液置蒸发皿中,蒸去乙醇,剩余水液上聚酰胺层析柱(1 cm×25 cm层析柱,称聚酰胺1.8 g,湿法装柱),先用20 mL水冲洗(6 mL/min),再加入70 mL甲醇冲洗,收集甲醇液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系考察
精密吸取上述橙皮苷浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下分别进样20 μL,测定。以峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程为：A＝27 248 838.6C＋91 201.7,r＝0.999 7。表明橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μL,重复进样5次,计算5次峰面积的RSD＝0.83%。
2.6 稳定性试验
取室温放置的对照品溶液,在上述色谱条件下,于0、1、2、4、8、24 h分别进样20 μL,测定峰面积的RSD＝0.71%,表明橙皮苷甲醇溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
精密量取供试品(批号060812)10 mL各5份,按“样品测定”项下操作,计算含量,结果分别为0.216 1、0.214 9、0.218 1、0.218 5、0.217 1 ㎎/mL,平均含量为0.216 9 mg/mL,RSD＝0.94%。
学术论文发表
2.8 回收率试验
采用加样回收法。精密量取同一批已测知含量的术后饮(批号060812,含量0.216 9 mg/mL)样品5 mL(6份),分别置具塞锥形瓶中,均分为3组,每组依次加橙皮苷对照品溶液(浓度0.220 8 mg/mL)4、5、6 mL,按供试品的制备与测定法,在上述色谱条件下进行测定,计算回收率,结果见表1。表1 回收率试验结果(略)
2.9 样品测定
取3批样品,按“2.3”项下方法分别制得供试品溶液,分别吸取对照品及供试品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定，按外标法计算样品中橙皮苷的含量。结果见表2。表2 橙皮苷含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 橙皮苷纯化处理
我们曾采用有机溶媒直接萃取分离法,但乳化现象严重,不易操作。经反复试验,采用在样品中加入适量硅藻土搅匀、烘干后,用甲醇超声提取,滤液蒸去甲醇后,再用70%乙醇溶解并转移至分液漏斗中,用石油醚萃取除去脂溶性成分,最后经聚酰胺层析柱[2]进一步分离制备供试液,结果比较满意。
3.2 含量测定方法考察
我们对供试品溶液制备的关键步骤进行了考察。①提取溶剂和提取方法的确定：试验中曾比较了甲醇水浴回流提取和超声提取,结果回流提取杂质较多,超声处理简便快速,杂质较少,超声40 min可将样品中橙皮苷提取完全。在超声提取溶剂的选择时,分别采用70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇超声提取,结果70%乙醇、70%甲醇提取液颜色较深,杂质较多；乙醇提取液颜色较浅,杂质较少,但提取率较甲醇略低。经比较后确定用甲醇作为超声提取溶剂。②超声时间的确定：平行精取样品(批号060810)6份,加硅藻土烘干后,分别精密加入甲醇120 mL,分别超声处理10、20、30、40、50、60 min,结果超声40 min,橙皮苷的提取已趋于完全,所以超声时间确定为40 min。
3.3 最佳洗脱体积的选择学术论文发表
平行精密量取样品(批号060810)6份,按“2.3”项下方法操作,分别用40、50、60、70、80、90 mL甲醇洗脱,结果70、80、90 mL甲醇洗脱液中橙皮苷含量无明显变化,且对70 mL甲醇洗脱后的柱子继续洗脱,结果没有检测出橙皮苷,所以洗脱体积确定为70 mL。
3.4 流动相的选择
我们比较了甲醇-醋酸-水、乙腈-磷酸-水和乙腈-醋酸-水不同比例的流动相系统,结果发现,采用乙腈体系所得色谱图峰形好。本试验以乙腈-0.2%磷酸(21∶79)作为流动相,出峰时间适宜,分离效果较好。
【参考文献】
1] 张善飞,郭平平,田燕华,等.HPLC测定益胃胶囊中芍药甙、橙皮甙、甘草酸的含量[J].中成药,2001,23(4)：252－254.
[2] 张小琼,何燕常.HPLC测定珍珠胃安丸中橙皮苷的含量[J].中成药, 2006,28(3)：447－448.
[3] 徐韧柳,王永欣.健胃消食片质量标准研究[J].中成药,2006,28(4)：506.
[4] 袁金斌,周志炎.HPLC测定陈皮提取物及制剂中橙皮苷的含量[J].中成药,2006,28(3)：455－456.
[5] 李红卫,李 平,焦海胜,等.乳病消片质量标准的研究[J].中成药,2006, 28(9)：1300－1303.
[6] 饶春恺,谭忠军,宋 军.HPLC测定参苓健脾胃颗粒中橙皮苷的含量[J].中成药,2006,28(10)：1542－1543.学术论文发表
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【关键词】 高效液相色谱法；术后饮；橙皮苷；含量测定
Key words：HPLC；Shuhouyin；hesperidin；content determination
术后饮系甘肃武威肿瘤医院研制的医院制剂,是由太子参、白花蛇舌草、陈皮、甘草等药味制成的合剂,具有补气理气、行气宽中、降逆下气的功能,用于手术后气血亏虚所致的腑气不通诸症的治疗。经过临床多年使用,疗效显著。为控制其质量,参考文献[1-6],采用高效液相色谱(HPLC)法对方中君药陈皮的主要有效成分橙皮苷进行了含量测定,结果方法简便、准确、重复性好,为术后饮质量标准的研究与指标的制定提供了试验依据。
1 仪器与试药
SSI PC-2000型高效液相色谱仪,Model500紫外检测器,7725i手动进样阀,分析之星色谱工作站；XT120A电子分析天平(瑞士普利赛斯)；HS10260D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。
橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110721-200512,供含量测定用)；术后饮样品及缺陈皮的阴性对照样品均由甘肃武威肿瘤医院提供(批号060810,060812, 060815)。水为重蒸馏水,乙腈为色谱纯,聚酰胺为层析用试剂(80～100目),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连江申分离科学技术公司)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速：0.8 mL/min；检测波长：284 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。在上述色谱条件下,橙皮苷与相邻峰达到基线分离,且阴性对照无干扰,峰形对称,分离效果良好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品25.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,然后用甲醇溶解至刻度,摇匀,配成浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液,精密吸取2 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备学术论文发表
精密量取本品10 mL,置具塞锥形瓶中,加硅藻土5 g,搅拌均匀,烘干,精密加入甲醇120 mL,称定重量,充分搅拌,超声40 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液100 mL置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣用70%乙醇100 mL使溶解并转移至分液漏斗中,加石油醚(60～90 ℃)萃取3次(50、30、20 mL),弃去石油醚液,分取70%乙醇液置蒸发皿中,蒸去乙醇,剩余水液上聚酰胺层析柱(1 cm×25 cm层析柱,称聚酰胺1.8 g,湿法装柱),先用20 mL水冲洗(6 mL/min),再加入70 mL甲醇冲洗,收集甲醇液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系考察
精密吸取上述橙皮苷浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下分别进样20 μL,测定。以峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程为：A＝27 248 838.6C＋91 201.7,r＝0.999 7。表明橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μL,重复进样5次,计算5次峰面积的RSD＝0.83%。
2.6 稳定性试验
取室温放置的对照品溶液,在上述色谱条件下,于0、1、2、4、8、24 h分别进样20 μL,测定峰面积的RSD＝0.71%,表明橙皮苷甲醇溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
精密量取供试品(批号060812)10 mL各5份,按“样品测定”项下操作,计算含量,结果分别为0.216 1、0.214 9、0.218 1、0.218 5、0.217 1 ㎎/mL,平均含量为0.216 9 mg/mL,RSD＝0.94%。
【摘要】 目的 建立术后饮中橙皮苷含量的测定方法。方法 采用高效液相色谱法,色谱柱为CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79),流速为0.8 mL/min,检测波长为284 nm,柱温为室温,进样量为20 μL。结果 橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好,平均回收率为98.59%,RSD＝0.72%。结论 方法简便、准确、重复性好,可作为术后饮中橙皮苷的含量测定方法。
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【关键词】 高效液相色谱法；术后饮；橙皮苷；含量测定
Content Determination of Hesperidin in Shuhouyin by HPLC WANG Gang, ZHAO Liang-cun1.Wuwei Institute for Drug Control, Wuwei 733000, China；2.Gansu Wuwei Cancer Hospital, Wuwei 733000, China Abstract：Objective To establish a HPLC method for the content determination of hesperidin in Shuhouyin. Methods Chromatographic assay was performed on CenturySIL C18-AQ (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column at room temperature. The mobile phase was acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution (21∶79). The flow rate was 0.8 mL/min. The detection wavelength was at 284 nm. The sample size was 20 μL. Results Good linear relationship of hesperidin achieved in the range of 1.004～10.04 μg. The average recovery rate was 98.59% with RSD＝0.72%. Conclusion The method is simple, accurate and stable with good reproducibility. This method can be used for determination of hesperidin in Shuhouyin.
Key words：HPLC；Shuhouyin；hesperidin；content determination
术后饮系甘肃武威肿瘤医院研制的医院制剂,是由太子参、白花蛇舌草、陈皮、甘草等药味制成的合剂,具有补气理气、行气宽中、降逆下气的功能,用于手术后气血亏虚所致的腑气不通诸症的治疗。经过临床多年使用,疗效显著。为控制其质量,参考文献[1-6],采用高效液相色谱(HPLC)法对方中君药陈皮的主要有效成分橙皮苷进行了含量测定,结果方法简便、准确、重复性好,为术后饮质量标准的研究与指标的制定提供了试验依据。
1 仪器与试药
SSI PC-2000型高效液相色谱仪,Model500紫外检测器,7725i手动进样阀,分析之星色谱工作站；XT120A电子分析天平(瑞士普利赛斯)；HS10260D超声波清洗器(天津市恒奥科技发展有限公司)。
橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号110721-200512,供含量测定用)；术后饮样品及缺陈皮的阴性对照样品均由甘肃武威肿瘤医院提供(批号060810,060812, 060815)。水为重蒸馏水,乙腈为色谱纯,聚酰胺为层析用试剂(80～100目),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果学术论文发表
2.1 色谱条件
色谱柱：CenturySIL C18-AQ(250 mm×4.6 mm,5 μm,大连江申分离科学技术公司)；流动相：乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速：0.8 mL/min；检测波长：284 nm；柱温：室温；进样量：20 μL。在上述色谱条件下,橙皮苷与相邻峰达到基线分离,且阴性对照无干扰,峰形对称,分离效果良好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品25.1 mg,置25 mL量瓶中,加甲醇适量,超声助溶,然后用甲醇溶解至刻度,摇匀,配成浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液,精密吸取2 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取本品10 mL,置具塞锥形瓶中,加硅藻土5 g,搅拌均匀,烘干,精密加入甲醇120 mL,称定重量,充分搅拌,超声40 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液100 mL置蒸发皿中,水浴蒸干,残渣用70%乙醇100 mL使溶解并转移至分液漏斗中,加石油醚(60～90 ℃)萃取3次(50、30、20 mL),弃去石油醚液,分取70%乙醇液置蒸发皿中,蒸去乙醇,剩余水液上聚酰胺层析柱(1 cm×25 cm层析柱,称聚酰胺1.8 g,湿法装柱),先用20 mL水冲洗(6 mL/min),再加入70 mL甲醇冲洗,收集甲醇液水浴蒸干,残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm微孔滤膜过滤后备用。
2.4 线性关系考察
精密吸取上述橙皮苷浓度为1.004 mg/mL的甲醇溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在上述色谱条件下分别进样20 μL,测定。以峰面积对浓度进行线性回归,得回归方程为：A＝27 248 838.6C＋91 201.7,r＝0.999 7。表明橙皮苷浓度在1.004～10.04 μg范围内线性关系良好。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液20 μL,重复进样5次,计算5次峰面积的RSD＝0.83%。
2.6 稳定性试验
取室温放置的对照品溶液,在上述色谱条件下,于0、1、2、4、8、24 h分别进样20 μL,测定峰面积的RSD＝0.71%,表明橙皮苷甲醇溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
精密量取供试品(批号060812)10 mL各5份,按“样品测定”项下操作,计算含量,结果分别为0.216 1、0.214 9、0.218 1、0.218 5、0.217 1 ㎎/mL,平均含量为0.216 9 mg/mL,RSD＝0.94%。
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2.8 回收率试验
采用加样回收法。精密量取同一批已测知含量的术后饮(批号060812,含量0.216 9 mg/mL)样品5 mL(6份),分别置具塞锥形瓶中,均分为3组,每组依次加橙皮苷对照品溶液(浓度0.220 8 mg/mL)4、5、6 mL,按供试品的制备与测定法,在上述色谱条件下进行测定,计算回收率,结果见表1。表1 回收率试验结果(略)
2.9 样品测定
取3批样品,按“2.3”项下方法分别制得供试品溶液,分别吸取对照品及供试品溶液各20 μL,注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定，按外标法计算样品中橙皮苷的含量。结果见表2。表2 橙皮苷含量测定结果（略）
3 讨论
3.1 橙皮苷纯化处理
我们曾采用有机溶媒直接萃取分离法,但乳化现象严重,不易操作。经反复试验,采用在样品中加入适量硅藻土搅匀、烘干后,用甲醇超声提取,滤液蒸去甲醇后,再用70%乙醇溶解并转移至分液漏斗中,用石油醚萃取除去脂溶性成分,最后经聚酰胺层析柱[2]进一步分离制备供试液,结果比较满意。
3.2 含量测定方法考察
我们对供试品溶液制备的关键步骤进行了考察。①提取溶剂和提取方法的确定：试验中曾比较了甲醇水浴回流提取和超声提取,结果回流提取杂质较多,超声处理简便快速,杂质较少,超声40 min可将样品中橙皮苷提取完全。在超声提取溶剂的选择时,分别采用70%乙醇、乙醇、70%甲醇、甲醇超声提取,结果70%乙醇、70%甲醇提取液颜色较深,杂质较多；乙醇提取液颜色较浅,杂质较少,但提取率较甲醇略低。经比较后确定用甲醇作为超声提取溶剂。②超声时间的确定：平行精取样品(批号060810)6份,加硅藻土烘干后,分别精密加入甲醇120 mL,分别超声处理10、20、30、40、50、60 min,结果超声40 min,橙皮苷的提取已趋于完全,所以超声时间确定为40 min。
3.3 最佳洗脱体积的选择学术论文发表
平行精密量取样品(批号060810)6份,按“2.3”项下方法操作,分别用40、50、60、70、80、90 mL甲醇洗脱,结果70、80、90 mL甲醇洗脱液中橙皮苷含量无明显变化,且对70 mL甲醇洗脱后的柱子继续洗脱,结果没有检测出橙皮苷,所以洗脱体积确定为70 mL。
3.4 流动相的选择
我们比较了甲醇-醋酸-水、乙腈-磷酸-水和乙腈-醋酸-水不同比例的流动相系统,结果发现,采用乙腈体系所得色谱图峰形好。本试验以乙腈-0.2%磷酸(21∶79)作为流动相,出峰时间适宜,分离效果较好。
【参考文献】
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