博莱霉素长效制剂与普通制剂对小鼠肺组织损伤诱导作用的比较
【摘要】 目的 研究肌肉注射博莱霉素聚乳酸羟基乙酸微球长效制剂和普通制剂对小鼠的肺组织损伤的不同作用。方法 取90只昆明小鼠随机分为博莱霉素聚乳酸羟基乙酸微球长效制剂组，普通制剂组和对照组，长效制剂组在第1和20天给药70 mg/kg，普通制剂组每隔3 d给药10 mg/kg，持续给药40 d，两组均注射140 mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。观察每组小鼠的体重，肺部病理改变情况及测定肺部羟脯胺酸含量。结果 长效制剂组和普通制剂组小鼠用药后的平均体重均较对照组明显降低(P<0.01)。用药40 d后，普通制剂组的肺部形成广泛且稳定的肺部纤维化病理改变，而长效制剂组无明显的纤维化形成。在用药后的第20和40天取出小鼠肺部，测得长效制剂组的肺部羟脯氨酸含量〔分别为(299±25)和(347±31)μg/g〕显著低于普通制剂组〔分别为(521±33)和(624±53)μg/g〕(P<0.01)。结论 肌肉注射博莱霉素普通制剂可引起小鼠肺部形成广泛的纤维化，而肌肉注射长效制剂仅引起轻微的肺损伤,不会产生明显的肺纤维化，该长效制剂具有比普通制剂更小的副作用。
【关键词】 博莱霉素;微球;长效制剂;肺损伤
临床上治疗皮肤癌、肝癌、头颈部癌、肺癌、食管癌、宫颈癌以及恶性淋巴瘤的主要方法均采用博莱霉素等化疗药物〔1〕。博莱霉素是一种从链霉菌中分离得到的抗癌抗生素，它是几种糖肽的混合物，主要分为A、B两大类，博莱霉素A2是这些混合物的主要成分〔2〕。博莱霉素用药后对肺部有一定副作用，其聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)长效制剂比较普通制剂具有减少给药次数及提高生物利用度的优点，本文拟通过观察昆明小鼠的体重，肺部病理改变以及测定小鼠肺部羟脯胺酸含量来分析博莱霉素长效制剂对小鼠的肺部损伤，以为其临床应用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 动物 中国昆明小鼠90只，雌雄各半，体重(20±2)g，3～4周龄，由吉林大学动物实验中心提供(SCXK?(吉)2008?0005)。随机分为3组，每组各30只。即博莱霉素PLGA微球长效制剂组，普通制剂组和对照组。其中，长效制剂组在给药的第1和20天肌肉注射博莱霉素PLGA微球长效制剂70 mg/kg，普通制剂组每隔3 d给药10 mg/kg，持续给药40 d。
1.2 药品、试剂与仪器 博莱霉素注射剂(日本化药株式会社)，自制博莱霉素PLGA微球长效制剂，羟脯氨酸试剂盒(南京建成生物工程研究所)，BX51显微镜(日本Olympus公司)，T18匀浆机(德国IKA公司)。
1.3 小鼠的活动观察和体重测定 每日称量各组小鼠的体重，计算平均体重并记录活动情况。
1.4 小鼠肺部标本采集 给药后第20和40天，各取10只小鼠，注射戊巴比妥钠麻醉后，开胸后结扎右支气管后，取出右肺，在-80℃下保存，用以测量羟脯氨酸含量。取出小鼠的左肺，放入10%甲醛中固定，石蜡包埋切片并进行HE染色〔3〕。
1.5 小鼠肺组织羟脯氨酸测定 小鼠的肺组织匀浆后，用碱水解比浊法参照试剂盒说明测定各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量并取平均值。
1.6 小鼠肺部病理检查 第20和40天处死小鼠取出肺部标本制成的HE染色片随机取出多个，均在100倍显微镜下的多个视野连续比对观察肺部纤维化病变程度。
1.7 统计学处理 采用SPSS11.0进行t检验。
2 结 果
2.1 各组小鼠的活动状况和体重变化 两用药组小鼠活动状况无异常，饮食排便与对照组无明显差异。两用药组小鼠均出现不同程度的体重降低，其中长效制剂组和普通制剂组小鼠体重最低分别出现在给药后第10和8天，平均体重分别为给药前的77.35%和63.36%，与对照组相比均显著降低(P<0.01)，但两用药组间小鼠体重未见显著差异。随后两用药组小鼠体重均逐渐回升。
2.2 用药组小鼠肺组织羟脯氨酸的含量 第20和40天处死的长效制剂组小鼠肺组织羟脯氨酸含量〔分别为(299±25)和(347±31)μg/g〕显著低于普通制剂组〔分别为(521±33)和(624±53)μg/g〕(P<0.01)。 2.3 用药组小鼠的肺组织病理学改变 第20和40天处死的对照组小鼠的肺组织结构清晰，组织未见炎细胞浸润，肺泡壁完整，没有增宽，无肺泡萎陷，没有出现血管壁增厚等现象，支气管腔和肺泡的泡腔内均未见有炎性渗出物。通过显微镜观察，可见长效制剂组小鼠的肺组织在用药后的第20天少量肺泡出现间隔增厚，成纤维细胞、毛细血管增生等现象，但肺内大部分结构依然正常。用药后第40天出现肺泡炎症，主要表现有肺泡间隔增厚，病灶内肺泡萎陷，也可见肺部被一些成纤维细胞和上皮细胞占据，间质中可见一些胶原纤维。普通制剂组小鼠的肺组织在用药后第20天表现为小灶状或大片状炎性细胞浸润，肺泡腔及肺间质内有大量红细胞渗出。用药后第40天表现为广泛的稳定纤维化，其间有大量炎症细胞侵润，肺部成大片融合，多处肺泡结构消失(图1)。 图1 普通制剂组小鼠的肺组织病理切片(×100) 3 讨 论 羟脯氨酸是构成胶原蛋白特有的氨基酸，与胶原蛋白的形成呈正比，所以在本实验的设计中通过测定羟脯氨酸的含量可以反映胶原蛋白含量，同时羟脯氨酸含量也随肺泡壁损伤程度而增加，所以其含量可以反映肺部纤维化的程度。长效制剂组小鼠肺部的羟脯氨酸含量明显低于普通制剂组，可以从化学检测角度上佐证长效制剂对肺部的损伤少于普通制剂。 两用药组的小鼠体重在用药伊始均见减少，分析可能跟博莱霉素用药后对肺部有一定伤害作用所致，其中博莱霉素导致肺间质纤维化的发病机制目前掌握的不是很多。导致发生肺纤维化的原因普遍认为是肺成纤维细胞的通讯功能下调、纤维化相关基因和多种细胞因子的异常表达会引起肺部的纤维化相关信号转导途径激活有一定关系〔4〕。临床应用博莱霉素普通制剂时成人每次剂量在15～30 mg，用生理盐水2～3 ml溶解后肌肉注射，每周给药2～3次。1个疗程总给药量为300～600 mg，需持续用药2个月之久。如此长时间频繁注射给药，给病患带来了很大的心理和生理上的负担。运用聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)包裹博莱霉素制备可肌肉注射给药的微球制剂，每20天注射一针，一个短疗程仅需注射2针，可极大提高病患的依从性和耐受性〔5〕。本研究发现，博莱霉素长效制剂导致程度较低的肺损伤，并未形成明显的间质纤维化，既可满足减少给药次数，提高生物利用度，又可以降低其副作用，减少对病患的肺部损伤。 【参考文献】
1 Masanori Sugiyama，Takanori Kumagai.Molecular and structural biology of bleomycin and its resistance determinants〔J〕.J Biosci Bioengi，2002;93(2)：105?16.
2 Liu YB，Wu F，Zou GL.Electrophoresis mobility shift assay and biosensor used in studying the interaction between bleomycin A5 and DNA〔J〕. Analytica Chimica Acta，2007;599：310?4.
3 张晓晔,宁 欣，刘卫青，等.静脉注射和气管内滴入博莱霉素诱导小鼠肺纤维化的差异〔J〕.中国实验动物学报，2008;16(3)：176?8.
4 Antje Moeller，Kjetil Ask，David Warburton,et al.The bleomycin animal model：a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2008;40：362?82.
