原百部碱在大鼠体内药动学研究

【摘要】  目的建立原百部碱在大鼠体内HPLC测定方法，研究原百部碱静脉注射后在大鼠体内的药动学特点。方法大鼠静脉注射原百部碱不同时间点眼眶取血，HPLC测定原百部碱的血药浓度，3P87软件处理数据。结果大鼠血清样品中原百部碱在0.10～12.60 μg/ml范围内线性关系良好，大鼠静脉注射原百部碱后药时曲线符合双室模型,分布速率常数为2.69h-1, 消除速率常数为0.69 h-1 ，AUC为3.82 mg·h·L-1。结论所建立的血药浓度测定方法操作简便、准确灵敏、重现性好，可用于原百部碱在大鼠体内的药动学研究。原百部碱静脉注射后分布和消除均较快。

【关键词】  原百部碱； 百部； 药动学； 高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of protostemonine in rat plasma and to study pharmacokinetics parameters in rats after i.v.injection.MethodsAfter taking protostemonine through i.v.injection, rat plasma samples were collected at different time points, and they were determined by HPLC and 3P87 to calculate data.ResultsThe results showed that the linear range of calibration curve was within drug plasma concentration of 0.10～12.6 μg/ml, and the pharmacokinetics of protostemonine in rats were fitted to two-compartment model. ConclusionThe method has good selectivity, sensitivity and reproducibility，which can be used for pharmacokinetic studies of protostemonine in rat plasma. Due to its fast absorption and elimination, it can be made into slow and controllable released preparations.

　　Key words： Protostemonine;   Radix Stemonae;   Pharmacokinetics；  HPLC
    
　　百部是临床治疗咳嗽的常用有效中药，又名“嗽药”，功擅润肺止咳，可用于治疗新久咳嗽，如急、慢性支气管炎、百日咳及肺结核等疾病，疗效确切。中药百部既没有吗啡、可待因的成瘾性和呼吸抑制作用，又没有右美沙芬导致出现幻觉、错觉或其它精神不正常症状的副作用，具有广阔的开发前景。据文献报道，百部镇咳作用的有效成分为生物碱［1～3］，但相关的体内研究报道较少。本文以从蔓生百部中分离得到的、具有较强的镇咳活性的原百部碱单体为指标性成分，通过建立原百部碱在大鼠体内HPLC测定方法，研究原百部碱静脉注射后在大鼠体内的药动学特点，为百部生物碱新剂型设计和临床用药提供科学依据。

　　1  仪器与材料

　　1.1  材料原百部碱对照品( 自制，批号20041205, 纯度为98.0％ ) ,其余试剂为分析纯或色谱纯。  

　　1.2  动物清洁级SD 大鼠由上海中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体质量（200±50）g。

　　1.3  仪器与设备Agilent 1100高效液相色谱仪，(在线脱气机，二元泵，柱温箱，色谱管理系统)，美国安捷伦公司产品；色谱柱:依利特 Hypersil ODS 25 μm，250 mm×4.6 mm；LG 16-W高速离心机，北京医用离心机厂；XW-80A旋涡混匀器，上海精科实业有限公司；DL-4000B冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；UV-2401 PC紫外分光光度计，日本岛津；Gilson移液器，法国吉尔森公司。

　　2  方法和结果

　　2.1  HPLC测定大鼠体内原百部碱的方法学考察

　　2.1.1  检测波长的选择 将原百部碱单体用甲醇配成适宜浓度，经全波长扫描，最大吸收波长为305 nm。

　　2.1.2  HPLC测定色谱条件优选后的色谱条件为：固定相：Hypersil ODS， 250 mm×4.6 mm；流动相：乙睛∶0.25％甲酸铵（25∶75）；检测波长：305 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：25℃。

　　2.1.3  原百部碱标准溶液配制精密称取原百部碱对照品10.10 mg，用甲醇定容至10 ml,浓度为1 010 μg/ml，并依次稀释成浓度为101.0， 50.50， 25.25， 12.62， 6.310， 3.155， 1.578， 0.7890， 0.394 5 μg/ml的系列对照品溶液， 密封、低温、避光保存备用。

　　2.1.4  血清样品的预处理参考文献报道［4］，确定的血清样品的预处理方法为：用微量移液器吸取血清200 μl于1.5 ml离心管中，加600 μl甲醇沉淀蛋白，于涡旋混合器上充分混合30 s ，离心(4 000 r/min) 15 min ，取上清液，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，取滤液20 μl 进样。

2.1.5  分析方法验证方法的专属性：
    
　　在上述色谱条件下，空白血清中的内源性物质不干扰原百部碱的测定，血清样品中原百部碱的理论塔板数大于5 000 ,与相邻色谱峰分离度均大于1.5。
    
　　标准曲线的制备：取空白血清200 μl，加入原百部碱系列标准溶液各100 μl，甲醇500 μl，配制成相当于原百部碱浓度为12.6，6.30，3.15，1.58，0.79，0.40，0.20，0.10，0.05 μg/ml的血清样品，按“2.1.4”依法操作，进样20 μl，记录色谱图；以待测物的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归计算，获得的标准曲线为Y=0.977 6+46.478 3X，线性相关系数r值为0.999 7，线性范围为0.10～12.60 μg/ml，最小检测限（S/N>3）为0.025 μg/ml，最小定量限（S/N>10）为0.082 μg/ml。
    
　　含量测定方法的精密度实验、回收率和稳定性实验：取“标准曲线的制备”项下低、中和高3个浓度（原百部碱的质量浓度分别为0.10、1.58和12.6 μg/ml）的对照品溶液，按“2.1.2 ”项下条件分别连续测定5次，求算本法的精密度，RSD分别为6.58％，1.32％和0.97％。
    
　　取9份200 μl空白血清，分别加入0.40，6.31，50.5 μg/ml 3个浓度的原百部碱标准溶液100 μl，甲醇500 μl，按“2.1.4”项下依法操作，得0.10，1.58，12.6 μg/ml3个浓度的原百部碱血清样品溶液，进样20 μl，测定峰面积；同时测定0.10，1.58，12.6 μg/ml 3个浓度的原百部碱标准溶液的峰面积，以两者峰面积比计算原百部碱在血清中的回收率，结果分别为90.9％，96.6％，95.8％， 平均回收率为94.4％，(n=9)，RSD为3.20％。
    
　　本实验考察了原百部碱血清样品室温放置的稳定性，结果表明12 h内被测样品溶液峰面积下降了3.47％，24 h后峰面积下降了9.27％，故样品应在12 h内测定。  

　　2.2  大鼠静脉注射原百部碱体内药动学研究

　　2.2.1  给药方案与样品采集取SD 健康大鼠12只,雌雄各半,体质量在(200±50) g 之间 ,给药前禁食不禁水12 h ,将原百部碱样品用生理盐水配制10 mg/ml的浓度，以10 mg/kg的剂量经大鼠尾静脉注射给药(给药体积1.0 ml/kg )，并于给药后0.125，0.25， 0.5，0.75，1，1.5，2，3 h眼眦取血0.6 ml ,置于1 ml离心管中,离心，取血清200 μl于1.5 ml离心管中,按“2.1.4”项下操作,由标准曲线方程计算原百部碱的血药浓度。

　　2.2.2  研究数据原百部碱大鼠静注给药后不同时间点血药浓度测定结果见图2。

　　2.2.3  统计结果由3P87药物动力学软件对数据进行处理，以大鼠的平均血药浓度和时间计算药动学参数，通过R值及AIC法综合判断房室模型。曲线的拟合以两室模型为最好，权重系数1/C2。结果见表1。表1  药动学参数（two-compartment）（略）

　　3  讨论
    
　　本文优选的原百部碱HPLC色谱条件，原百部碱的理论塔板数大于5  000，分离度大于1.5，最小检测限为0.025 μg/ml，最小定量限为0.082 μg/ml，可用于原百部碱体外和体内的测定。
    
　　血清样品在12 h内基本稳定，但在室温和冷藏条件下放置过夜后再处理进样, 原百部碱峰面积下降率较大，提示原百部碱在血清中长时间放置不稳定。因此处理好的血清样品应尽量在当天测定，原百部碱血清标准液宜随行配制。
    
　　据AIC法判断,原百部碱在大鼠体内的药时过程符合二室模型。分布速率常数为2.69/h，消除速率常数为0.69/h ，AUC为3.82 mg·h·L-1。表明大鼠静注原百部碱后，快速地分布到中央室，然后逐渐向周边室转运，在中央室和周边室之间进行着可逆性的转运。药物在中央室按一级过程消除，半衰期为1.0 h，消除较快，提示原百部碱静脉注射后药效维持时间也较短，可考虑部分制成缓控释制剂，以延长原百部碱在体内的药效维持时间。

【参考文献】
  　　［1］Hoi-Sing Chung, Po-Ming Hon, Ge Lin . Antitussive Activity of Stemona Alkaloids from Stemona tuberose［J］. Planta med，2003，69: 914.

　　［2］H Greger.Structural relationships,distribution and biological activities of stemona alkaloids［J］.Planta Med, 2006,72(2)：99.

　　［3］PH Leung, L Zhang, Z Zuo. Intestinal absorption of stemona alkaloids in a caco-2 cell model［J］. Planta Med， 2006，72(3)：211.

　　［4］姜少灏，康丽娟，蒋晔，等龙胆及其复方中龙胆苦苷在大鼠体内的药动学研究［J］.中国药学杂志，2005，40（3）：212.