云南红豆杉中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ含量的固相萃取-高效液相色谱法测定

【摘要】  目的建立以固相萃取-高效液相色谱（HPLC）法测定云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量。方法固相萃取柱：Agilent ODS C18 500 mg/3 ml; 色谱柱：Agilent zorbax SB-C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：甲醇－水－乙腈（35∶55∶10），流速1.0 ml·min-1，检测波长227 nm，柱温30℃。结果10-去乙酰巴卡亭Ⅲ在 1.6～8.0 μg·ml-1范围内，进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 9，平均回收率为96.8％，RSD为 4.8 %(n= 6)。结论该方法可用于云南红豆杉枝叶中10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的含量测定，方法稳定，结果准确、可靠。

【关键词】  固相萃取-高效液相色谱法； 红豆杉； 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ

　云南红豆杉Taxus yunnanensis中的抗肿瘤化合物主要是以紫杉醇(Taxol)为代表的二萜类紫杉烷化合物，红豆杉中紫杉醇含量极低，且从树皮中分离会对植物资源造成破坏。10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-DAB Ⅲ）是云南红豆杉中的紫杉烷类二萜化合物，其本身具有很好的抗癌活性，同时也是合成紫杉醇的前体物［1］，且从枝叶中即可获得，故对其进行开发利用既可保护稀有树种红豆杉，同时对提高资源利用率有着积极意义。我们建立了固相萃取-高效液相色谱（SPE -HPLC）法，对云南红豆杉枝叶中10-DAB Ⅲ进行含量测定。

　　1  试剂与试药
    
　　Agilent 1100高效液相色谱仪; 固相柱：Agilent ODS C18 500 mg/3 ml;Sartorius Cp3245型天平；KQ-500DE型医用数控超声仪（江苏昆山超声仪器有限公司）；DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司)；LABOROTA 4000旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司); LG10-2.4A离心机(北京医用离心机厂)。10-DAB Ⅲ对照品（Sigma公司产品，纯度>99%）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯；药材采自云南大理云龙县, 经南方医科大学生药学教研室鉴定为云南红豆杉Taxus yunnanensis Cheng et L.K.Fu的枝叶。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件色谱柱为Agilent zorbax SB- C18( 250 mm×4.6 mm，5 μｍ）；流动相为甲醇－水－乙腈（35∶55∶10），流速1.0 ml·min-1，检测波长227 nm，柱温30℃，进样量10 μl，检测器灵敏度0.04 AUFS。

　　2.2  供试品溶液的配制 精密称取云南红豆杉药材粉末10.0 g，醋酸乙酯∶丙酮（1∶1）60 ml，超声提取30 min， 离心10 min，取清液减压干燥，提取物以石油醚脱色，重复操作1次，提取物备用。取固相萃取小柱，加入甲醇20 ml，抽干洗柱，以0.01 mol/L的乙酸铵溶液湿润固相萃取柱；提取物溶于80％甲醇乙酸铵溶液，上柱，抽干，依次用0.01 mol/L的乙酸铵20 ml淋洗，抽干；40％的甲醇乙酸铵溶液40 ml，淋洗，抽干；80％的甲醇乙酸铵溶液40 ml，淋洗，收集洗脱液，减压干燥，干燥物用甲醇溶解，定容至5 ml，甲醇液经0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

　　2.3  对照品溶液的配置精密称取10-DAB Ⅲ对照品10 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声振荡使溶解，放冷至室温，甲醇定容至刻度，摇匀，配成0.4 mg·ml-1的对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，滤液作为对照品溶液待用。

　2.4  线性关系考察取上述对照品溶液，精密吸取 4，8，12，16，20 μl进样，按上述色谱条件作 HPLC 分析，以进样量m为横坐标，峰面积值A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程式：   
    
　　A=180.9 m-75.1  r=0.999 9
    
　　结果表明，在实验条件下10-DAB Ⅲ在 1.6～8.0 μg范围内，进样量与色谱峰面积呈良好的线性关系。

　　2.5  精密度实验取对照品溶液按上述色谱条件连续进样6次，记录10-DAB Ⅲ的峰面积，计算相对标准偏差。结果RSD为2.78%，表明色谱系统精密度良好。

　　2.6  稳定性实验按上述色谱条件，在配制供试品溶液后的 0，1，3，6，9，12 h分别进样，记录峰面积，计算相对标准偏差，结果RSD为2.80％，表明供试品溶液在 12 h内稳定。

　　2.7  重复性实验取云南红豆杉枝叶6份(批号060310)，每份 5ｇ，精密称定按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.1”色谱条件测定，记录峰面积，计算相对标准偏差，结果RSD为2.58%，表明方法的重复性良好。

　　2.8  回收率实验取已知含量样品6份，精密称定10 g，分别精密加入10-DAB Ⅲ对照品2 mg，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积并计算其含量，平均回收率为 96.8％，RSD为 4.8% (n= 6) 。结果见表1。表1  加样回收率实验结果（略）

　　2.9  结果取3个批号云南红豆杉枝叶粉末约5 g，精密称定，按“2.2”项下方法操作并按上述色谱条件进样分析，记录峰面积并计算其含量。结果见表2。色谱图及色谱峰保留时间见图1。表2  10-DAB Ⅲ含量测定结果

　　3  讨论

　　3.1  样品前处理方法选择为了准确测定样品，故对提取方法及提取时间分别进行了考察。实验结果表明，在所考察的回流提取法、超声提取法、连续回流提取法中，采用超声提取法对有效成分的提取效果最优。

　　3.2  固相萃取柱的运用红豆杉枝叶中含有大量化学结构和极性等与10-DAB Ⅲ结构相似的其它紫杉烷类化合物，因此给分离检测工作带来很大困难，同时，红豆杉树叶提取物中往往含有大量的蜡、脂类等物质，这些杂质的存在，严重影响了色谱柱的寿命，用固相柱对样品进行处理后再进行含量测定，可以去除杂质的干扰，也保护色谱柱。

　　3.3  固相柱的洗脱用0.01 mol/L的乙酸铵、40％的甲醇乙酸铵溶液淋洗可去除大量大极性的色素类杂质，淋洗液经检测均不含目标物；80％的甲醇乙酸铵溶液40 ml，淋洗，目标物经去杂后富集于此；最后用甲醇溶液淋洗固相柱，甲醇淋洗液中经检测不含目标物。

　　3.4   红豆杉中的10-DAB Ⅲ1988年，Donis等人首先报道了紫杉醇的半合成，随后Keith等也发表了相似的报导，它们均以Taxus baccata的针叶中所含的丰富的10-DAB Ⅲ作为二萜骨架的原料，选择性保护其中的部分羟基，然后与化学合成的侧链连接，去除保护基得到紫杉醇。紫杉醇的半合成方法已比较成熟，国外己用半合成法生产紫杉醇。美国食品和药物管理局于1994年批准半合成紫杉醇在美国应用。半合成前体来源的扩大以及合成技术的发展将缓解紫杉醇供应紧张局面，因而具有重大的社会意义和经济意义［2］。

　　3.5  样品的选择云南红豆杉是红豆杉树种中含紫杉烷等抗癌成分比较高的树种，但也仅有ppm级的含量［3,4］，且红豆杉的生长速度特别缓慢，资源较少，故用可再生的枝叶作为材料，这样以10-DAB Ⅲ为原料，开发抗癌新药既可以保护资源，又提高了资源的利用率［5］，甚至开发出的新产品可以降低紫杉醇的昂贵价格及使用时的不良反应，这有待同行的共同努力。

【参考文献】
  　［1］Bissery M C, Guenad D, Voegelin G, et al. Experimental antitumor activity of taxotere, a taxol analogue［J］.Cancer Res, 1991, 51(18): 4845

　　［2］杜智敏，陈瑞玲，刘福清, 等.HPLC法测定东北红豆杉枝叶中10-脱乙酰巴卡亭Ⅲ的含量［J］.中草药, 2004, 35(4)：398.

　　［3］周秀玲，彭全材.高效液相色谱法测定红豆杉枝叶中紫杉醇的含量［J］.时珍国医国药, 2009，19(6): 1434.
　
　　［4］孔繁晟, 罗佳波，刘莉. 云南红豆杉中总黄酮含量的测定［J］.中国药房,2006,17(17): 1342.

　　［5］杨陶，李明，陈建民.红豆杉中紫杉烷类化合物制备10-去乙酰巴卡亭Ⅲ［J］.复旦学报(自然科学版), 2004, 43(6):70.