中药复方对2型糖尿病大鼠的胰腺中Bcl-2、Bax表达的影响

【摘要】  目的研究中药复方——本草消渴丹对糖尿病模型大鼠胰腺组织凋亡相关基因Bcl-2和Bax表达的影响，探讨复方中药治疗糖尿病的作用机理，为临床用药提供科学依据。方法将32只Wistar大鼠随机分为正常对照组8只，造模组24只。造模组给予高糖、高脂饲料3周后，一次性腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ，25 mg/kg），继续予高糖、高脂饲料4周，造模成功后，随机分为糖尿病模型组、复方中药治疗组和阳性药物对照组，分别给予生理盐水、本草消渴丹和二甲双胍片灌胃4周，每周末断尾取血检测空腹血糖值。治疗4周后检测各组大鼠血糖变化，用RT-PCR检测胰腺凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达变化。结果中药复方治疗组糖尿病大鼠的体质量增长明显比模型对照组快，血糖水平、血糖曲线下面积均低于模型对照组，凋亡相关基因Bcl-2的表达升高，而Bax表达降低。结论本草消渴丹治疗糖尿病的机制之一是通过抑制胰腺细胞的凋亡来实现的。

【关键词】  中药复方； 糖尿病； 凋亡； Bcl-2； Bax； 胰腺

　糖尿病是一种常见的内分泌系统代谢障碍性疾病，其发病率有逐年上升趋势，其特征性表现为高血糖和糖尿。西医方面虽有多种治疗方法和药物，但由于西药的毒副作用，使西药在糖尿病的治疗方面未能取得突破性进展。近年来，中医药在防治糖尿病方面表现出巨大的潜力，无论是单味中药还是中药复方，在治疗糖尿病方面均显示出很大优势［1,2］。本实验以验方生地、山药、枸杞和山萸肉为基础经提取制成本草消渴丹，通过干预2型糖尿病大鼠模型，观察其对2 型糖尿病大鼠血糖和胰腺凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达的影响，为临床用药提供科学依据。

　　1   材料与仪器

　　1.1  药物将复方中药（主要成分：生地20 g，山药20 g，枸杞子10 g，山萸肉15 g）分别用醇提水沉法提取、浓缩、干燥、制成颗粒剂，每克颗粒剂相当于原药材9.2 g，由河北大学医学部药剂教研室提供，以上药材购自保定市中药饮片有限公司。盐酸二甲双胍片，规格每片0.25 g，由天津太平洋制药有限公司提供，批号071204；链脲佐菌素（STZ）由美国Sigma提供，批号S-0130；TRI-ZOL和RT-PCR药盒等购自GIBCO-BRL公司, 100 bp DNA梯度标记物为PROMEGA公司产品。其他试剂均为市售产品。

　　1.2  仪器AR1530电子分析天平(1/1000，美国奥豪斯)；GT-1640京都血糖仪（SUPER GLUCOCARDⅡ）及试纸(由日本ARKRAY，Inct 提供)；PCR仪，型号T1/T1+，德国Biometra生产；SP-2102/756型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司生产；凝胶成像系统，BIO-RAD Company生产。

　　1.3  高脂饲料的制备［3］ 基础饲料：碳水化合物占60%，蛋白质占22%，脂肪占10% (植物脂肪为主)，其它成分占8%。高脂、高糖饲料由基础饲料加炼猪油10%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠1%，其中碳水化合物占50%，蛋白质占13%，脂肪占30%(动物脂肪为主)，其它成分占7%，由河北医科大学医学动物实验中心加工成饲料颗粒。

　　1.4  动物清洁级健康雄性Wister大鼠32只，体质量（281.18±11.38）g，由河北医科大学实验动物中心提供（合格证号604104），饲养在室温（20～25℃），相对湿度40%～70%的环境条件下，每笼8只，共分4笼，自由采食、饮水。

　　2  方法

　　2.1  造模与分组［3］ 将上述大鼠适应性饲养1周后，称重，随机分为两组，第1组8只为正常对照组，喂以基础饲料，第2组24只大鼠用于构造2型糖尿病模型。构造模型组以高脂、高糖饲料饲喂3周后，一次性腹腔注射STZ 25 mg/kg体质量(STZ溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所配浓度为10 mg/ml)；对照组腹腔注射相应体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。构造模型组继续高糖、高脂饲料饲养4周后，禁食12 h，按2 g/kg体质量灌喂20%D-葡萄糖溶液，做口服葡萄糖耐量试验，凡0 min和120 min血糖分别≥7.8 mmol/L或葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.0 mmol/L的大鼠［4］ 为造模成功。
    
　　选择造模成功的大鼠24只按体质量编号，参照随机数字表法分为3组，分别为模型组、二甲双胍组、本草消渴丹治疗组。各组均继续喂以高糖高脂饲料4周，并每周称体质量。

　　2.2  治疗第7周后，各组动物分别灌胃相应药物或生理盐水，1次/d，给药按人与大鼠体表面积比折算成等效剂量。对照组、模型组分别每日灌胃等剂量的生理盐水；二甲双胍组每日灌胃二甲双胍70 mg·kg-1，中药治疗组每日灌胃本草消渴丹1.25 g·kg-1。

　　2.3  糖耐量实验实验期末空腹8 h采尾静脉血后，以50%葡萄糖溶液灌胃，剂量为2.5 g/kg，然后检测在0，0.5，1，2 h后的血糖。由梯形累加法计算血糖曲线下区域面积（area under curve，AUC，mmol·h-1·L-1）。

　2.4  RT-PCR检测胰腺Bcl-2，Bax基因表达水平4周实验结束后，各组大鼠断颈处死，收集胰腺利用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。根据NCBI中cDNA序列设计Bcl-2和Bax引物，引物由大连宝生物公司合成，以β-actin mRNA作为检测的内参照。根据试剂盒说明进行RT-PCR，反应总体系为50 μl：10×One Step RNA PCR Buffer 5 μl，MgCl2 (25 mmol/L)10 μl，dNTP Mixture (10 mmol/L) 5 μl，RNase inhibitor (40 U/μl) 1 μl，AMV RTase XL (5 U/μl) 1 μl，AMV-Optimized Taq (5 U/L) 1 μl，上游特异性引物(20 μmol/L) 1 μl，下游特异性引物(20 μmol/L) 1 μl，RNA sample (≤1μg) 1 μl，RNase Free dH2O 24 μl。
    
　　取10 μl样品在2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描凝胶并进行定量分析，以β-actin为标准获得Bcl-2和Bax的相对表达水平。 PCR反应引物序列产物及退火温度见表1。表1 RT-PCR的引物序列、退火温度和产物长度（略）

　　2.5  数据分析应用SPSS15.0 的One-way ANOVA 进行方差分析，组间进行LSD法多重比较。

　　3  结果

　　3.1  实验前后血糖变化和糖耐量实验结果实验开始时，正常组与其他各组的空腹血糖都存在显著差别（P<0.05），4周后正常组和模型组的血糖都没有显著变化（P>0.05），而二甲双胍组和本草消渴丹组的血糖都显著降低（P<0.01）。本草消渴丹组4周后空腹血糖值显著低于模型组（P<0.01），与二甲双胍组和正常组间的差别无统计学意义（P>0.05）。糖耐量实验发现本草消渴丹组AUC显著高于正常组（P<0.05），显著低于模型组（P<0.05），与二甲双胍组间的差别无统计学意义（P>0.05）。见表2。表2  各组大鼠实验前后的空腹血糖变化和糖耐量实验结果（略）

　　3.2  胰腺Bcl-2和Bax表达变化本草消渴丹组的Bcl-2基因表达水平与正常组和二甲双胍组间无显著差别（P>0.05），与模型组间存在显著差别（P<0.05）。正常组与其他各组Bax基因的表达都存在显著差别（P<0.05），该基因的表达在二甲双胍组和本草消渴丹组显著低于模型组（P<0.05），本草消丹组与二甲双胍组间无统计学差异（P>0.05）。见表3和图1。表3  Bcl-2和Bax的mRNA表达水平（略）
    
　　与正常组比较存在显著差别，*P<0.05，与模型组比较存在显著差别，＃P<0.05

　　4  讨论
    
　　现代医学认为，胰岛β细胞的凋亡是糖尿病发病的重要机制［5］。凋亡受基因调控，其中最有效的调控物质是Bcl-2基因家族，它们在凋亡的基因调控中起着中心作用［6］。Bcl-2（B cell lymphoma-Leukemia-2，B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是Bcl-2家族成员中主要的抗凋亡因子，在抵抗细胞凋亡及延长细胞寿命方面的作用最具代表性，而Bax是凋亡促进基因。它们形成二聚体，调控蛋白酶和核酸酶活性，双向调节细胞凋亡。二者在细胞中的比例决定了细胞是否凋亡，当Bcl-2蛋白在细胞中过量表达时，与所有Bax结合，细胞存活，凋亡抑制；当Bax过量存在，与Bcl-2形成异源二聚体，则细胞凋亡［7～9］。

　　中医理论认为，糖尿病的主要病证为本虚标实，阴虚热盛、气阴两虚、阴阳两虚三证分别代表糖尿病病程发展的早、中、晚3个不同时期，其中阴虚贯穿本病始终，气阴两虚为其基本证候，血瘀为主要兼证［10］。
    
　　现代医学研究证明，生地黄为甘寒滋补通利之品，可以通过抑制血管内皮细胞血浆内皮素的释放而发挥抗血瘀作用［11，12］；山药提取物山药多糖和枸杞的重要成分枸杞多糖均有改善糖尿病鼠受损β细胞，降低血糖之功效［13～16］；而山萸肉有补益肝肾，涩精固脱之功效［17］。
    
　　中药复方 ——本草消渴丹是根据滋阴清热，润燥生津这一治则，在传统古方基础之上主要选用生地、山药、枸杞和山萸肉，经过现代工艺研制而成的新制剂。
    
　　本次实验结果表明，糖尿病对照组胰腺组织中抗凋亡基因Bcl-2表达显著降低，凋亡促进基因Bax显著升高，而通过灌服二甲双胍2.13 mg/（10 g·d）后Bcl-2表达恢复正常水平，Bax表达虽有降低，但没有恢复正常水平。灌服中药复方的糖尿病大鼠的Bcl-2表达恢复至正常水平，而Bax表达高于正常大鼠。说明本草消渴丹有上调糖尿病变大鼠凋亡抑制基因Bcl-2表达和下调凋亡促进基因Bax表达的作用，从而抑制糖尿病胰腺β-细胞的凋亡，其效果与二甲双胍相同，可以作为治疗糖尿病的方剂。

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