珠子参多糖抗肝癌作用的实验研究

【摘要】  目的观察珠子参多糖(Panax japlcus var Polysaccharide,PJPS)对小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制效应及其机制。方法分别建立BALB/c小鼠H22肝癌移植实体瘤模型及腹水瘤模型，将小鼠随机分为3组，即生理盐水组(阴性对照）、5-氟尿嘧啶组（阳性对照）、珠子参多糖组。给药结束后比较各用药组的抑瘤率、胸腺指数、脾指数、肿瘤组织细胞形态结构，肿瘤细胞超微结构、肿瘤细胞凋亡率、CD4+/CD8+值、外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率。结果珠子参多糖组的胸腺指数、脾指数、CD4+/CD8+值，外周血血清中血管内皮生长因子含量及生命延长率均高于5-氟尿嘧啶组，珠子参多糖组的抑瘤率及肿瘤细胞凋亡率低于5-氟尿嘧啶组，珠子参多糖组的部分肿瘤细胞有坏死现象及凋亡学形态变化。结论珠子参多糖对H22肝癌小鼠具有抑制肿瘤生长、延长生命的作用。提高机体细胞免疫功能，干扰肿瘤细胞周期，降低VEGF的表达可能是珠子参多糖发挥抗肝癌效应的机制。

【关键词】  珠子参； 多糖； 肝癌； 肿瘤抑制

　　Abstract：ObjectiveTo observe the anti-tumor activity of Panax japlcus var Polysaccharide (PJPS) on transplanted tumor H22 in mice and its mechanism.MethodsH22 transplanted solid hepatocarcinoma model and the ascites hepatocarcinoma model were established.The BALB/c mice were randomly divided into 3 groups:normal saline group(negative control group)，5-fluorouracil group(positive control group),and PJPS group. After administration,the inhibitory rate of tumor,the thymus index ,the spleen index,tumor cell morphology,and ultrastructure,the rate of apoptosis of tumor cell,CD4+/CD8+ ratio,level of VEGF and the rate of life extension were determined. ResultsThe thymus index,spleen index,CD4+/CD8+ ratio,level of VEGF and the rate of life extension in PJPS group were higher than those of 5-FU group,but the inhibiting rate of  tumor and the apoptosis rate of tumor cell were lower than those of 5-FU group.The tumor cells of PJPS group partly died . The tumor cell nucleus of PJPS group concentrated, and tumor cells got smaller. ConclusionPJPS can inhibit the growth of hepatoma carcinoma cells of H22 tumor-bearing mice. Improving the cellular immune function, interfering with tumor cell cycle and reducing the expression of VEGF may be the mechamisms of antitumor effect.

　　Key words： Panax japlcus var ;   Polysaccharide ;  Liver cancer;  Tumor suppressor

    珠子参Panax japlcus var,major又名扣子七，属五加科人参属植物，主要分布于东喜马拉雅至我国西部山区。其根茎为药材珠子参，具有活血散瘀，补血止血，消肿止痛之功。我们在早期的研究中发现珠子参水煎液有较好的抗肝癌作用［1，2］，但珠子参多糖的抗肝癌作用尚未有相关报告。而目前对多糖的诸多研究表明其有很好的抗肿瘤活性［3～7］。本课题拟研究珠子参多糖治疗肝癌的作用机制，从而为开辟抗肝癌新药提供新的线索。

　　1  材料

　　1.1  动物及瘤株雄性BALB/c纯系小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（20±2）g，共80只，由湖北省实验动物中心提供，动物合格证号为：SCXK(鄂)2003-0005。小鼠肝癌H22瘤株(H22细胞)由三峡大学医学院免疫教研室提供。

　　1.2  药品及试剂珠子参：购于宜昌市沿江中药房，经宜昌市药检所鉴定，产地：神农架，批号：200703；5-氟尿嘧啶(5-FU)针剂：上海旭东海普药业有限公司，批号：20070123，灭菌生理盐水稀释至一定浓度，避光常温保存；Mouse VEGF ELISA Kit：上海船夫生物科技有限公司；小鼠CD3-FITC/CD4-PE、CD3-FITC/CD8-PE：苏州生物基因有限公司；RPMI-1640培养液:Gibco公司，批号：1342878。

　　2  方法

　　2.1  药物及试剂制备

　　2.1.1  珠子参多糖水提醇沉法提取珠子参粗多糖，经活性炭脱色、链霉蛋白酶-Sevag法除蛋白、透析袋去除小分子杂质后得到珠子参精制糖。

　　2.1.2  5-FU在超净工作台避光条件下，无菌生理盐水稀释5-FU针剂至一定浓度后分装于EP管并用锡纸遮盖保存于4 ℃冰箱。

　　2.2  动物模型的制作将浓度为5.0×106个/ml的肝癌细胞悬液注射至健康BALB/c小鼠右腋皮下，每只0.2 ml，建立实体瘤模型；按上法小鼠腹腔内接种H22细胞悬液建立腹水瘤模型。

　　2.3  动物分组及给药造模后随机分组，每组10只小鼠。从第2天起分组给药：生理盐水组（normal saline,NS）（阴性对照）：灌胃0.2 ml生理盐水+腹腔注射0.2 ml生理盐水，1次/d，连续给药11 d；5-氟尿嘧啶组（5-fluorouracil,5-FU）（阳性对照）：腹腔注射0.2 ml 5-FU+灌胃0.2 ml生理盐水，剂量为25 mg/kg体重，隔日1次，共6次。间隔期间以生理盐水替代5-FU腹腔注射；珠子参多糖组（panax japlcus var polysaccharide,PJPS）：灌胃0.2 ml珠子参多糖+腹腔注射0.2 ml生理盐水，1次/d。剂量为50 mg/kg体质量，连续给药11 d。

　　2.4  指标测定

　　2.4.1  抑瘤率给药结束后实体瘤模型眼球取血处死小鼠，计算公式如下：抑瘤率（%）=(1-实验组肿瘤质量模型组肿瘤质量)×100%

　　2.4.2  胸腺指数及脾指数无菌条件下剥离小鼠胸腺及脾脏，称重。按下列公式计算胸腺指数及脾指数：胸腺指数=胸腺重量（mg）小鼠重量(g)脾指数=脾重量(mg)小鼠重量(g)

　　2.4.3  观察肿瘤组织细胞形态结构的变化取各组小鼠肿瘤组织，10 %甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肿瘤生长、坏死及对周围组织的浸润等情况。

　　2.4.4  观察肿瘤细胞超微结果的变化经取材、固定、脱水、浸透、包埋和切片染色后用于透射电子显微镜观察。

　　2.4.5  肿瘤细胞周期分析利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，分析细胞周期各时相的百分比及凋亡细胞所占比例。

　　2.4.6  T细胞亚群的检测利用流式细胞仪检测小鼠脾脏中CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+ T细胞亚群数量。

　　2.4.7  荷瘤小鼠血清中VEGF含量测定小鼠眼球取血，用干净试管收集血液，室温凝固2 h，离心2 000×g 15 min，收集血清。ELISA检测血清中VEGF含量。

　　2.4.8  观察对小鼠生存时间的影响从第13天起停止给药，记录小鼠存活天数。给药后生存时间不足5 d的予以排除。按下列公式计算生命延长率：
生命延长率（ILS）=
用药组平均生存天数－阴性对照组平均生存天数阴性对照组平均生存天数×100%

　　2.5  实验数据统计采用±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用独立样本t检验,统计数据采用SPSS 10.0处理。

3  结果

　　3.1  各组小鼠肿瘤生长情况的比较小鼠接种7 d后各组可触及右腋皮下肿块，阴性对照组小鼠肿瘤生长迅速，局部肿胀，有明显触摸感，用药组肿瘤生长相对迟缓。用药组抑瘤率检测结果见表1。表1  珠子参多糖对H22实体瘤小鼠瘤重的影响(略)

　　3.2  对小鼠免疫器官的影响各用药组的胸腺指数及脾指数见表2。表2  珠子参多糖对H22实体瘤小鼠胸腺及脾指数影响(略)

　　3.3  光镜观察肿瘤细胞形态结构的变化光镜下阴性对照组肿瘤细胞的形态结构见图1，珠子参多糖组的肿瘤细胞形态结构见图2。

　　3.4  肿瘤细胞超微形态观察电镜下阴性对照组的肿瘤细胞超微形态结构见图3，珠子参多糖组肿瘤细胞超微形态结构见图4，5-FU组肿瘤细胞超微结构见图5。

　　3.5  流式细胞仪检查肿瘤细胞DNA含量并进行周期分析的结果各用药组肿瘤细胞周期及凋亡率见表3。表3  珠子参多糖对H22实体瘤小鼠肿瘤细胞周期及凋亡率的影响(略)

　　3.6  对CD4+，CD8+ T细胞亚群水平的影响 结果见表4。表4  珠子参多糖对H22实体瘤小鼠脾脏中T细胞亚群的影响(略)

　　3.7  对荷瘤小鼠血清中VEGF浓度的影响试剂盒标准品吸光值A与浓度C的线性方程：A = 0.004 1C + 0.240 1（r = 0.999 6）。各组小鼠血清中VEGF表达情况如表5。表5  珠子参多糖对H22实体瘤小鼠血清VEGF水平的影响(略)

　　3.8  对荷瘤小鼠生存状况的影响除5-FU组外，其他各组小鼠接种后5天左右腹部膨大，手触摸明显比接种前柔软，同时小鼠活动开始减少，食欲减退，毛发蓬松。5-FU组小鼠接种后7d左右出现腹水征。用药组生存时间观察结果见表6。表6  珠子参多糖对H22腹水瘤小鼠生存时间的影响(略)

　　4  讨论

    在本实验中，珠子参多糖组小鼠的瘤重量低于阴性对照组，且差异有显著的统计学意义。其抑瘤率为34.44%，虽然低于5-FU组，但仍显示出该药对H22荷瘤小鼠肿瘤生长有较强的抑制作用。另外荷瘤小鼠生存状况优于5-FU，生存时间与5-FU相比差异虽无统计学意义，但其值高于5-FU组，说明中药提取物在抑制肿瘤生长方面效果不如传统化疗药物，但在改善荷瘤小鼠生存质量及延长生命方面具有优势。

　　4.1  提高小鼠免疫功能肿瘤的存在可抑制机体的免疫功能。胸腺、脾脏作为重要的免疫器官，其重量的降低往往伴随免疫功能的衰退。实验结果显示，珠子参多糖组的胸腺指数、脾指数均高于阴性对照组，提示珠子参多糖能有效阻止肿瘤机体免疫器官的萎缩，从而起到免疫激活作用，但其保护免疫器官的具体作用机制还有待进一步的研究。T细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群体之一，淋巴细胞CD4+/CD8+比值是反应机体免疫紊乱的敏感指标,当免疫功能受抑制时, CD4+/CD8+比值减少［8］。在本实验中，珠子参多糖组CD4+/CD8+比值高于阴性对照组（P＜0.05），这说明珠子参多糖能够改善荷瘤小鼠的细胞免疫状况。同时，珠子参多糖组脾脏中CD4+T细胞数量、CD4+/CD8+比值均高于5-FU组（P＜0.01），显现出与化疗药相比其在提高荷瘤机体免疫力方面的优势。

　　4.2  干扰肿瘤细胞的生长周期及诱导肿瘤细胞凋亡细胞周期是反映细胞生存状况的重要指标之一, 在细胞周期调控机制中有两个重要点,分别位于G1期与S期。肿瘤细胞G0/G1期阻滞,是拮抗肿瘤细胞发展的一个重要机制［9］。本实验中与阴性对照组比较,珠子参多糖组G0/G1期细胞增多，S期细胞比例减少，表明珠子参多糖可使肿瘤细胞停留于细胞周期的G0/G1期,阻止其进入S期，使DNA的合成受到抑制和阻断,从而有效地控制癌细胞的增殖，促进其凋亡。

    凋亡受阻是肿瘤发生的可能机制。本实验的结果表明，与阴性对照组比较，珠子参多糖能加重肿瘤细胞凋亡，其凋亡率为14.25%，高于阴性对照组，且差异有统计学意义。电镜超微结构显示，珠子参多糖组细胞体积变小，细胞质浓缩。部分细胞染色质出现早期凋亡的空泡结构；部分细胞核裂解为碎块，包膜内陷并包裹胞内成分形成凋亡小体；胞浆内线粒体肿胀变形，呈现凋亡的特征性形态改变。

　　4.3  影响肿瘤血管相关细胞因子的生成研究表明，肿瘤的增殖和转移依赖于血管形成［10］。VEGF被认为是最强的血管形成促进因子［11］，而在肝癌细胞中，VEGF的表达比邻近组织明显升高，VEGF在肝癌新生血管中起关键作用［12］。本实验结果显示与阴性对照组相比各用药组VEGF表达水平均下降，差异有统计学意义。其中以5-FU组水平最低。表明珠子参多糖可以有效抑制VEGF表达，从而影响肿瘤血管的生成，但作用效果不如5-FU。

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