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圆二色光谱在生物大分子研究中的应用

热度0票浏览324次时间：2020年4月08日 10:50

林小红

（福建省泉州第五中学）

摘要：生物大分子的构象与其表现出来的生物活性有着密切的关系，因此圆二色光谱技术是生物大分子研究中常用且重要的分析手段。本文简单介绍了蛋白质、核酸、多糖的圆二色性，并举例介绍了圆二色光谱在这些生物大分子研究中的应用。

关键词：圆二色光谱；蛋白质；核酸；多糖

1前言

一束平面偏振光可以看成是相同频率和振幅的左、右圆偏振光的迭加，当这两束偏振光通过光活性介质时，如果它们的波长在该光活性的生色团的吸收范围内，由于光吸收的不同，透射后的两束光的振幅有不同的减少，这样透射光的迭加就就形成了一个椭圆偏振，这种现象称为圆二色性，通过记录不同波长处所对应的椭圆率就得到圆二色谱（CD）

[1] 。

目前圆二色谱被广泛应用于生物大分子的结构和功能的研究。CD谱对溶液中的蛋白质、核酸等生物大分子的二级及三级结构变化高度灵敏，能检测到其微小的改变，因此该测定技术在生物大分子结构分析中得到了很多的应用。

2生物大分子的圆二色性

2.1 蛋白质的圆二色性

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质一般有一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次。

在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性 [2] 。

蛋白质的CD光谱一般分为两个波长范围，即178~250nm为远紫外区CD光谱，250~320 nm为近紫外区CD光谱。远紫外区CD光谱反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况 [3] 。因此，具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生CD谱带的位置、吸收的强弱都不相同。

2.2核酸的圆二色性

核酸是核苷酸的聚合物，由五碳糖和磷酸骨架及含氮碱基组成，并形成双螺旋结构。

双螺旋结构又具有A、B和Z等多种构型，其中B构型最为常见。核酸的CD信号由不对称的主链上的核糖分子以及螺旋结构产生。DNA的含氮碱基，如腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)，它们的结构是平面对称的，本身并没有光学活性，当碱基连接到不对称核糖的1'位碳原子上后，碱基生色团电子跃迁受到不对称环境的影响产生相互作用，因而可以产生很强的CD谱信号。碱基不同、糖的类型不同都会导致核酸的构象不同，以致它们的CD图谱特征不同 [4] 。已知核酸CD光谱图中275nm处强的正峰是由于DNA的碱基对堆积而产生的，在245nm处的负峰是由于DNA的双螺旋结构而产生的 [5] 。

2.3多糖的圆二色性

生色基的种类、空间取向及连接方式的多样性决定了糖类化合物结构的复杂性，这使得CD的数据处理更为繁琐。而且多糖的空间构象，不能以简单的术语如α -螺旋，β -折叠来描述。在溶液状态下，多糖常以无序卷曲形式存在，它们要么伸展或折迭。当然，有时也会存在螺旋结构，但是在轴向上，单位长度上所含残基的数目差别较大。尽管如此，现在从糖类化合物CD的形状和强度，仍可以了解到多糖的一级结构和空间构象等方面的结构信息，甚至可以作为糖类化合物结构变化的一种检测手段 [1] 。

3圆二色光谱在生物大分子研究中的应用

3.1 CD谱在蛋白质研究中的应用

3.1.1 蛋白质结构的确证

CD谱被广泛用于蛋白二级结构确证的研究中，不同厂家生产的仪器都带有用于结构分析的软件，可以有效的计算出α -螺旋、β -折叠、转角、不规则卷曲的比例。史新昌等 [6] 用CD仪分析重组人干扰素α -2a的二级结构，得到的CD谱图如图1所示，用自洽方法的改进程序CDSSTR进行测量，得出重组人干扰素α -2a的二级结构比例（表1）。

图1 4批重组人干扰素α -2a的CD谱图

表1 4批重组人干扰素α -2a的二级结构比例

对圆二色谱测量结果的拆分和估算，目前的软件不下十几种，得到研究者广泛认同的计算模式有峰回归（Ridge Regression，拟合程序CONTIN/LL）；单值分解（SingularValue Decomposition，拟合程序SVD）；神经网络（Neural Network，拟合程序K2D）；自洽方法（Self-Consistent Methods，拟合程序SELCON或CDSSTR）；多级线性回归（Mul-tilinear Regression，拟合程序G&F、LINCOMB或MLR）等。

3.1.2 蛋白质稳定性研究

蛋白质多不稳定，容易受到环境因素如温度、pH和浓度等得影响，根据CD谱图的变化，可以考察影响蛋白质稳定性的外部因素。

田素艳等 [7] 采用远紫外圆二色光谱法系统地研究了细胞红蛋白(cytoglobin，Cygb)的浓度、环境温度、溶液的pH值和溶剂性质对细胞红蛋白二级结构的影响。结果表明：当Cygb浓度<1μ mol/L时，它主要以α -螺旋形式存在，其α -螺旋含量>60%；当Cygb浓度从0.3μ mol/L增大到2.0μ mol/L时，其α -螺旋含量迅速降低；当Cygb浓度>2.0μ mol/L时，其α -螺旋含量随浓度的增大变化很小（约30%）。随着温度的升高，Cygb的α -螺旋含量逐渐减小，但即使温度达到368K，它仍保持有20%的α -螺旋结构，说明该蛋白具有较高的热稳定性。在弱酸性和弱碱性溶液中，Cygb的二级结构都会有不同程度的破坏。在甲醇和乙醇中，Cygb的α -螺旋含量明显增加，这说明醇类可以诱导其α -螺旋的生成。

赵超等 [8] 研究了神经红蛋白（NGB）的浓度、溶剂性质、溶液pH 值以及温度对NGB 二级结构的影响。当NGB浓度小于10μ mol/L时，它主要以α -螺旋形式存在，浓度大于10 μ mol/L时，随着浓度的增大其α -螺旋含量逐渐减少，当浓度达到40μ mol/L后基本不再变化，可能是由于NGB 在浓度较高时其分子间可以形成二硫键以及蛋白分子间可相互聚集所造成的。NGB在醇中的α -螺旋含量比在水中稍有增加，也表明NGB对醇类溶剂具有较高的稳定性。在酸性或碱性溶液中，NGB 的二级结构都有不同程度的破坏。随着温度的逐渐升高，NGB 的α -螺旋含量逐渐减少，但温度高达110℃时仍有16.8%的α -螺旋存在，说明NGB具有高热稳定性。

3.1.3 药物与蛋白质的相互作用研究

药物进入体内与体内各种蛋白的相互作用直接影响着药物的分布、游离浓度、代谢、稳定性、毒性等，因此研究药物与体内蛋白的相互作用对指导药物设计和临床用药意义重大。

陈克海等 [9] 利用圆二色光谱研究了长春新碱（VCR）与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用。298K时VCR与HSA相互作用后的CD谱图见图2，其中a到e分别代表不同的VCR和HAS的摩尔比（0，0.6，1.3，2.7和3.5）。从图2可以看出，当加入一定量的VCR后，HSA在远紫外区域的CD信号强度加强，形状和肩峰的位置发生明显移动，说明VCR可能破坏了HSA的二级结构，在一定程度上加速了α -螺旋向β -折叠的转变。通过CD光谱仪自带的二级结构分析软件计算的结果为α -螺旋的含量从51.7%下降到32.9%，β -折叠的含量升高9.2%，从而证明VCR与HSA的相互作用引起了HSA二级结构的改变。

图2 VCR与HAS相互作用的CD谱图

3.2CD谱在核酸研究中的应用

核酸是重要的遗传物质，对其研究是生物学、医学等学科中最活跃的领域之一。

相关的研究方法有很多，如核磁共振法、X射线衍射法、荧光光谱法、电化学法等，而CD法，以其快捷、迅速、灵敏、样品用量少等优点，在相关研究中受到了越来越多地关注，前景广阔。

图3 ctDNA的圆二色光谱（1.ctDNA；2.MP-ctDNA）

核酸可以和许多化合物、特别是一些药物分子发生可逆或不可逆的相互作用，这些小分子化合物与核酸作用的形式和位点影响到核酸的生理和物理化学性质，改变了核酸的转移和复制。因此，小分子物质与核酸的相互作用的研究，对药物的作用机理以及以核酸为靶标的药物分子的设计有一定的意义 [4] 。王峰等 [5] 用圆二色光谱对吗啡与小牛胸腺脱氧核糖核酸（ctDNA）、酵母核糖核酸（yRNA）的作用方式进行了研究。CD谱中ctDNA在275和245nm处有一强度相当的正峰和负峰，符合B型DNA的特征。当吗啡加入到ctDNA中时，后者的圆二色光谱图中负峰比正峰的变化略大一些，说明吗啡与ctDNA发生相互作用并使得ctDNA的螺旋发生了变化。

王瑞斌等 [10] 应用圆二色光谱研究了不同N/P（聚合物/质粒）时阳离子基因载体聚酰胺和DNA的相互作用。结果表明，不同N/P时阳离子基因载体对DNA 的二级结构影响程度不同，阳离子聚合物的量越多，和DNA之间的相互作用越强。结果对进一步研究阳离子基因载体运输治疗基因的作用机理具有参考价值。

DNA一般以双链形式存在，同时也存在三链和四链结构. G-quadruplex是四链结构的一种，该结构是由富含G（鸟嘌呤）的序列在Na + 或K + 溶液中形成，其中每一层是G与G之间通过氢键形成G-quartet结构

[11] 。王文星等 [11]

通过将参与形成四链结构

G-quadruplex的G（鸟嘌呤）碱基分别替换为T（胸腺嘧啶）、C（胞嘧啶）和A（腺嘌呤），用圆二色光谱系统地研究了不同位置的G对G-quadruplex结构稳定性的贡献。

3.3 CD谱在多糖研究中的应用

陈小强等

[12]

采用圆二色光谱和高效液相凝胶渗透色谱-蒸发光散射检测（HPG-PC-ELSD）技术，初步研究了2种方法提制的茶多糖（TPC）溶液构象和均一性组分分布的变化情况。CD谱显示TPC-1在194nm呈现1个正Cotton效应峰，热处理后在216nm处增加1个正Cotton效应峰；TPC-2经热处理后其中2种均一性组分TPC-2a和TPC-2b未变化，CD谱显示TPC-2在203、215 和272 nm处均呈现显著的正Cotton效应峰，经热处理后前2个峰消失。98℃水浴热处理改变了低温复合酶法提制的茶多糖复合物TPC-1溶液构象和均一性组分的分布，未改变沸水煎煮提制的TPC-2的均一性组分的分布和凝胶色谱行为，但影响了其溶液构象。

图4 树舌多糖CF2a的CD谱图

（实线：未修饰的CF2a；虚线：刚果红修饰的CF2a）多糖、特别是中性多糖的圆二色性分析，因其缺少一般紫外区可提供信息的结构，难以得到由CD分析提供的结构信息，因此可以对多糖进行局部修饰，得到更丰富的结构信息。梁忠岩等 [13] 对树舌多糖CF2a进行分子整体修饰，即与刚果红形成络合物，此络合物的CD谱（图4）除了在229，239nm处形成很强的正Cotton效应，表明CF2a以有序结构与刚果红形成络合物，在206，208处尚有负的Cotton效应，表明其可能为有序构象。

4. 展望

圆二色光谱可以帮助测量和观察生物大分子的结构和构象变化，因此圆二色光谱技术已经成为生物物理和生物化学研究中的一个非常重要的手段。除了生物大分子之外，还有很多有机分子，特别是药物分子，也有手性的结构，能对左、右旋光的吸收表现出差异性。圆二色光谱技术也是研究这些分子结构的重要工具。相信随着技术的进一步的发展，圆二色光谱技术会以其更为完善的功能和更为精确的结果成为生命科学与医学研究者的有力工具。■

参考文献

[1] 段金友，方积年. 圆二色谱在糖类化合物结构研究中的应用[J]. 天然产物研发与开发，2004,16(1):71-74.

[2] 沈星灿，梁宏等. 圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展 [J]. 分析化学，2004,32(3) :388-394.

[3] 沈琼，黄滨等. 运用圆二色谱研究酶与化合物相互作用的机理[J]. 中山大学学报，2006,45(4) : 62-64.

[4] 刘振佳，司伊康等. 圆二色谱测定技术在小分子化合物与DNA相互作用研究中的应用[J]. 药学学报，2010,45(12):1478-1484.

[5] 王峰，黄薇等. 光谱法研究吗啡与核酸的相互作用[J]. 分析化学研究简报，2007,35(1):111-114.

[6] 史新昌，饶春明等. 重组人干扰素α -2a(IFNα -2a)的圆二色谱分析[J]. 药物分析杂志，2005,25(10):1169-1172.

[7] 田素艳，李连之等. 圆二色光谱法研究环境因素对细胞红蛋白二级结构的影响[J].

分析化学，2009,37(8):1197-1101.

[8] 赵超，李连之等. 重组人神经红蛋白的圆二色光谱研究[J]. 科学通报，2006,51(13):

1524-1528.

[9] 陈克海，郑学仿等. 长春新碱与人血清白蛋白的相互作用研究 [J]. 化学学报，2007,65(17):1887-1891.