白花丹素的体外肝毒性研究

【摘要】  目的观察白花丹素在体外对4种肿瘤细胞的作用及其在体外对人胚肝细胞L-O2的毒性作用。方法采用MTT法检测不同浓度白花丹素对肿瘤细胞和人胚肝细胞L-O2的毒性,比较其IC50值；采用紫外分光光度法测定白花丹素作用后肝细胞培养上清液中SOD,MDA,LDH值的变化。结果白花丹素在体外具有较强抗肿瘤作用，同时对人胚肝细胞L-O2有一定的毒性作用。结论白花丹素是优良的抗肿瘤药物，对肿瘤细胞有明显毒性作用，同时具有一定肝毒性，使用时应注意监测肝功能。

【关键词】  白花丹素； 人胚肝细胞L-O2； 肝毒性

　　Abstract:ObjectiveTo detect the antitumor effect of plumbagin and the toxicity of  plumbagin on human liver cell L-O2 in vitro. MethodsMTT assay was performed to test the toxicity of plumbagin on tumor cell and human liver cell L-O2 .The contents of SOD,MDA and LDH in cultural supernate were measured by ultraviolet spectrophotometry. ResultsPlumbagin had strong toxicity on tumor cells. Plumbagin inhibited the proliferation of human liver cell L-O2 in a dose-dependent manner.ConclusionPlumbagin is an excellent antitumor drug. Plumbagin has the inhibitory effect on proliferation of liver cells.

　　Key words:Plumbagin；  Human liver cell L-O2；  Toxicity of liver cell

    白花丹来源于蓝雪科蓝雪属，主要分布于西南省份，广西民间用于散疮、消肿、通经活络，并治蛇伤、风湿乳腺炎以及慢性气管炎等症。韦金育等［1］采用体外抗肿瘤药物筛选MTT法对50种广西常用中草药、壮药进行抗肿瘤筛选，在稀释1∶10 时白花丹对肝癌细胞呈现明显抑瘤作用，稀释1∶100 时白花丹仍有明显抑瘤作用，在29种有抑瘤作用的药物中，白花丹是具有明显抑瘤作用的5种药物之一，白花丹素(plumbagin 5-羟基-2-甲基-1，4-萘醌)是白花丹的主要物质基础，近年的研究结果表明白花丹素是白花丹中具有抗肿瘤作用的主要成分［2,3］。一般来说，抗肿瘤作用强的药物毒性也大，其对肝的毒性如何，未见有文献报道。本实验中，我们考察了白花丹素对人肝细胞L-O2的毒性作用。现报道如下。

　　1  材料与仪器

　　1.1  药物与试剂白花丹素标准品（中国药品生物制品检定所）；四噻唑蓝（MTT）（Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；RPMI1640培养基（美国GIBCOBRL公司）；胎生牛血清（杭州四季青生物材料研究所公司）；胰蛋白酶（美国Amresco公司公司）；谷氨酰胺（美国Amresco公司）；PBS（美国Amresco公司）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司）；注射用硫酸链霉素（大连美罗大药厂）；HEPES（Sigma公司）；LDH试剂盒（南京建成生物工程研究所）；MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

　　1.2  仪器二氧化碳培养箱（美国Forma Scientific公司）；倒置显微镜（日本Olympus公司）；酶标仪（芬兰thermo公司）；超低温冰箱（日本三洋公司）；96孔培养板（美国BIO-RAD公司）；超净工作台（苏州净化设备厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；电子天平（上海天平仪器厂）；电热恒温水浴锅（北京市医疗设备厂）；722S紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

　　1.3  细胞株人胚肝细胞L-O2细胞株（南京凯基生物科技发展有限公司）; 人胃癌细胞SGC7901，人乳腺癌细胞MCF-7，人肾癌细胞ketr-3，人肝癌细胞BEL 7404（南京凯基生物科技发展有限公司）。

　　2  方法

　　2.1  溶液的配置取RPMI-1640培养干粉以1 000 ml三蒸水充分溶解，加入NaHCO3 2.0 g, HEPES 4.766 g，加入青霉素、链霉素使其终浓度为100 U·ml-1， 在超净工作台中过滤除菌，分装成90 ml/瓶，-20℃保存备用，临用前加10 ml热灭活（56℃，30 min）胎牛血清。

　　2.2  梯度白花丹素溶液的制备精密称定白花丹素标准品适量用DMSO溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置成31.25，62.5，125，250，500 μg·ml-1浓度梯度的白花丹素系列浓度样品，置于4℃冰箱中保存备用。

　　2.3   细胞培养肿瘤细胞株和人胚肝细胞L-O2用含10%灭活新生牛血清的RPMI 1640培养基（加入谷氨酰胺0.24 g/L并用氢氧化钠调节pH值为7.2～7.4），置于37℃，5% CO2培养箱中培养，肿瘤细胞培养液每天更换，人胚肝细胞L-O2每2天换液1次。实验中所用细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。

　　2.4  MTT法测定白花丹素的体外抗肿瘤作用取对数生长期的肿瘤细胞株用胰酶消化后，用RPMI-1640培养液吹打制成细胞悬液加入96孔培养板，每孔180 μl，在5％ CO2,37℃培养箱培养12 h待细胞完全贴壁后，实验组加入白花丹素标准液10 μl每药三孔，阴性对照孔加入含0.5％ DMSO的无血清培养基20 μl，空白对照孔加入等量的含药无血清培养基而无细胞，各孔加培养基至200 μl，培养箱孵育24，48 h，加入5 mg/ml的MTT 10 μl，继续在培养箱培养4 h，取出96孔板倾去上清液，加入DMSO每孔150 μl，在摇床上振动摇匀，在酶标仪570 nm和630 nm的波长下测得各孔OD值。按下式计算白花丹素对各肿瘤细胞的抑制率。

    抑制率(%)＝ 对照组OD值-实验组OD值对照组OD值×100％

    实验重复3次，计算平均抑制率。

　　2.5  MTT法测定白花丹素的肝毒性按“2.4”项下方法在96孔培养板中加入人胚肝细胞L-O2悬液。待细胞完全贴壁后，实验孔加入系列浓度白花丹素20 μl每个浓度设3个复孔，并设阴性对照孔和空白对照孔。培养箱孵育24，48 h，同法测定白花丹素对人胚肝细胞L-O2的抑制率，计算平均抑制率及IC50值。

　　2.6  紫外分光光度法测定细胞培养上清液中的SOD，MDA，LDH值取对数生长期的人正常胚肝细胞L-O2用胰酶消化后，用RPMI-1640培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9 ml，在5％CO2,37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，实验孔加入125 μg·ml-1白花丹素标准品0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48 h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中所述方法进行SOD，MDA，LDH的测定。

　　2.7  统计学软件处理数据数据以±s表示，采用SPSS13.0软件进行处理。采用Bliss法求算IC50值。

　　3  结果

　　3.1  MTT法测定结果白花丹素组与空白对照组比较，在31.25～500 μg/ml浓度范围内，吸收度A值随药物浓度的增加逐渐减小，说明白花丹素对肿瘤细胞增殖有显著抑制作用，且具有剂量相关性。结果见表1。同时白花丹素具有一定的肝毒性。结果见表2。表1  白花丹素对肿瘤细胞的IC50值（略）表2  不同时间白花丹素L-02细胞株的毒性测定结果（略）

　　3.2  SOD，MDA，LDH测定结果用紫外光光度法测定培养上清液中的SOD、MDA、LDH值。结果见表3。表3  紫外分光光度法测定白花丹素对肝细胞的毒性作用（略）

　　4  讨论

    肝脏是外源性化学物质代谢的重要器官，在药物众多靶器官中无疑是最重要的，因此研究外源性化学物质对肝的影响是毒理学研究的重要组成部分［4］。研究药物肝毒性的传统方法多采用动物实验，但动物实验所需样品和动物量大，提取、分离并纯化大量中药成分比较困难，实验成本高。近年来，多种体外细胞培养体系已成为研究的有力工具，用培养细胞进行体外毒性分析已发展为早期毒性评价的重要替代方法，在中药新药开发早期建立有效的体外评价体系更是高通量筛选的手段之一［5］。本实验中，我们选取了来源体的人胚肝细胞L-O2为试验对象，考察白花丹素在体外对正常细胞的毒性作用。细胞建株通过在体外若干次的传代培养后基本可以消除不同人群的个体差异，具有很强的代表性，能切实反映出白花丹素的体外肝毒性。
    本实验结果表明白花丹素对人肝细胞L-O2有一定的毒性作用，且其抑制细胞生长随药物浓度的增加而增高。试验中白花丹素对肿瘤细胞 IC50值平均为45.24 μg·ml-1，对人正常胚肝细胞L-O2 IC50值为108.713 μg·ml-1。白花丹素对肿瘤细胞毒性选择指数（SI）为2.403，这说明白花丹素对肿瘤细胞具有一定的选择性毒性作用，对肝毒性较小。作为一个抗肿瘤药物，具有较大的抗肿瘤活性，较低的毒性才能在临床上得到应用，本实验结果可为该药的研究提供参考。

    国外有报道［6］，白花丹素可通过抑制启动阶段或启动后阶段致癌剂诱导的细胞过度增殖而对大肠癌具有预防作用。Srinivas等［7］研究了白花丹素诱导子宫癌细胞ME-180凋亡的作用及其可能机制，结果显示白花丹素可明显抑制ME-180细胞增殖，其可能机制是通过刺激ME-180。细胞内活性氧产生、损伤线粒体，使其膜电位下降，引起ME-180细胞凋亡，而且ME-180细胞凋亡率与白花丹素浓度呈正相关性。白花丹素抗肿瘤机制至今未有明确报道，可能与自由基有关，细胞受到氧化损伤时，自由基及其过氧化反应产物破坏细胞膜和细胞结构，导致细胞肿胀坏死，细胞内清除自由基酶的活性下降，导致其清除自由基能力下降，使肝细胞损伤进一步加重，膜通透性增高，肝细胞内重要物质LDH，MDA外泄［8］。据此，我们采用人胚肝细胞L－O2，以抗肿瘤药物白花丹素诱导肝细胞损伤为模型，通过测定白花丹素作用后的肝细胞为实验组，证明其机制可能与拮抗自由基产生，加强其清除和保护抗氧化酶活性有关。

【参考文献】
  　　［1］韦金育，李 延，韦 涛，等.50种广西常用中草药、壮药抗肿瘤作用的筛选研究［J］.广西中医学院学报，2003，6(4):3.

　　［2］王希斌，黄慧学，刘华钢，等.白花丹素和白花丹素-铜配合物体外抗肿瘤活性研究［J］.广西中医药，2008， 31（4）:50.

　　［3］Lin L C,Yang L L,Chou C J. Cytotoxic naphthoquinones and plumbagic acid glucosides from Plumbago zeylanica［J］.phytochemistry,2003,62:619.

　　［4］Guillouzo A. Liver cell models in in vitro toxicology［J］.Environmental Health Perspectives，1998，106( 2):511.

　　［5］刘庆,王旗,杨秀伟,等.基于NDCKII细胞的中药成分体外肾毒性评价［J］.中国药理学与毒理学杂志，2007，21（6）：521.

　　［6］贾旭东.细胞增殖和细胞调亡与癌的发生和预防［J］.国外医学·卫生学分册，2001，28（2）:65.

　　［7］Srinivas P，Gopinath G，Banerji A.Plumbagin induces reactive oxygen species which mediate apoptosis in human cervical cancer cells［J］.Mol Carcinog，2004，40:201.

　　［8］Kalf FC,Past GB,Snyder R.Sewent toxicology Recent advances in the toxicology of benzene,the glycolethers,and carbon tetrachloride［J］.Ann Rev Pharmocol Toxicol,1987,27:379.