天花粉蛋白的构效关系及进入细胞的途径

【摘要】  　　天花粉蛋白(Trichosanthin, TCS)因具有妊娠引产、抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等多种药理学作用而倍受关注。研究天花粉蛋白的结构特征，明确其活性中心及过敏原性区域对于深入了解天花粉蛋白的生物学功能十分重要。该文对近年来关于天花粉蛋白构效关系的研究进展作了综述，并着重介绍了天花粉蛋白进入细胞的具体途径，为研究其他的核糖体失活蛋白提供新的思路。

【关键词】  天花粉蛋白　核糖体失活蛋白　 构效关系

　　Abstract：Trichosanthin (TCS), a ribosome inactivating protein extracted from the root tuber of Chinese medicinal herb Trichosanthes kirilowii Maximowicz, has multiple pharmacological properties including abortifacient, anti-tumor, anti-HIV and immune regulation. The antigenicity and short plasma half-life limited its wide clinical administration. In this review, studies about locating antigenic sites and prolonging plasma half-life were discussed. Studies on structure–function relationship and mechanism of cell entry were also covered. Recently, TCS has been found to induce apoptosis, enhance the action of chemokines and inhibit HIV-1 intergrase. These findings give new insights on the pharmacological properties of TCS and other members of ribosome-inactivating proteins.

　　Key words：Trichosanthin；  Ribosome-inactivating protein；  Structure-function relationship

    天花粉蛋白（Trichosanthin, TCS）是从葫芦科植物栝蒌的块根中提取出来的分子量为27 KD的单链核糖体失活蛋白(Ribosome Inactivating Proteins, RIPs)，其基因序列及三级结构均已被阐明［1］。TCS在临床上被用于治疗宫外孕、绒毛膜上皮癌，恶性葡萄胎等。体外研究表明, TCS能抑制HIV病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒等多种病毒的复制［2，3］，对宫颈癌、白血病等肿瘤也有不同程度的抑制作用［4，5］，表明TCS具有多种药理学活性。但TCS是一种植物蛋白，可引起一系列过敏或类过敏反应，明确TCS的活性中心及过敏原性区域十分重要。本文就TCS结构与功能的关系以及TCS如何进入细胞的相关研究进展作一综述。

　　1  天花粉蛋白的基因序列和分子结构

    Collins等［6］于1990年报道了TCS的一级结构，序列分析表明该基因是一个连续表达的核苷酸序列，中间没有内含子及其它任何插入序列，它编码289个氨基酸，其中N端23个氨基酸的信号肽和C端 19个氨基酸在天然的 TCS中是不存在的。天然TCS的成熟肽有247个氨基酸，在起始密码子上游有数个TATA盒。潘克祯等［7］通过重建TCS分子模型并在2. 6A°分辨率进行晶体学修正，发现TCS分子的二级结构由8段α螺旋和13条β链组成。α螺旋长短不一，其中α4 、α5及α6为三段连续的a螺旋，且α5与活性中心有关。13条β链共组成4个β折叠层，最大的β折叠层由6条β链组成。从整个分子来看，α螺旋相对集中在蛋白质分子内部，而β链构成的β折叠层则分布在分子表面，这是TCS分子三维结构的显著特点。

　　2    天花粉蛋白的构效关系

　　2.1   活性位点分析基于天花粉蛋白已知的三级结构和限制性蛋白酶解分析发现，研究发现TCS潜在的活性位点位于110～174氨基酸区域，删除TCS的前100位氨基酸对其RNA-N-糖苷酶活性的影响并不大［8］，而120到123位氨基酸对天花粉蛋白的生物学活性至 关重要，删除或疏水化取代这一位置的氨基酸会导致其核糖体失活活性降低4 000倍［9］。除此之外，160和189位的谷氨酸也是TCS的关键位点，它们分别突变成丙氨酸后其核糖体失活活性降低了1 800倍［10］，去除这两个位点的谷氨酸残基后分子表面由负电荷变成正电荷，这导致其构像稳定性降低。还有研究表明［11，12］，14位酪氨酸和22位精氨酸参与蛋白质折叠过程，192位色氨酸则对决定活性位点和维持蛋白质稳定性十分重要。

　　2.2  过敏原性位点分析因存在一定的过敏原性限制了TCS广泛的临床应用，近来一些研究致力于通过基因突变减少TCS的过敏原性而不影响其效能。Chan等［13］删除TCS C-末端氨基酸序列发现TCS的过敏原性减少了2.7倍而其核糖体失活活性降低了10倍，An等［14］通过计算机建模推测其过敏原性位点主要位于TCS 81-83氨基酸位点和173位的赖氨酸和174位的精氨酸，通过定点突变后其核糖体失活活性与天然TCS无显著差异而过敏原性大大降低。

　　2.3  TCS具有RNA-N-糖苷酶活性的结构基础 天花粉蛋白具有RNA-N-糖苷酶活性,能水解真核细胞核糖体的28S rRNA的4 324位上的腺苷酸的N-C糖苷键,释放出一个腺嘌呤碱基，使核糖体不可逆失活,从而抑制蛋白质的合成。TCS的结构分析表明其RNA-N-糖苷酶催化活性分两步进行：识别和水解。TCS的活性口袋中有两个亚单位，一个是初始的底物识别位点（如第85位的谷氨酸－AMP识别位点），另一个是催化位点（如TCS与底物类似物NAPDH的结合位点）。最新研究发现［15］， TCS的底物与TCS结合后，稳定的水分子作为质子供体，TCS 163位精氨酸平衡水分子中的部分负电荷，形成氢键从而参与水解N-糖苷键。

　　3  天花粉蛋白进入细胞的途径

    作为一种核糖体失活蛋白，TCS需要进入细胞内作用于胞质中的核糖体而发挥其作用。TCS进入细胞的途径如图1所示（引自文献［16］并经笔者修改）。

　　3.1  与磷脂膜相互作用Xia等［17］研究发现磷脂可以通过固定水－气界面的TCS来增加TCS的浓度，表明TCS和磷脂膜之间存在相互作用。他们还研究发现静电作用是TCS与含负电荷磷脂膜之间相互作用的主要因素，增加Na +浓度至1.5 M并不会分离所有与磷脂膜结合的TCS，而且TCS与磷脂膜结合后并不会被完全脱离出来直到单层细胞膜崩解。当TCS被置于低PH值环境时其三级结构会发生改变，暴露更多的疏水位点。因此，TCS可以在酸性环境下与带负电荷的磷脂膜通过疏水作用相结合。Lu等［18］发现低PH值环境可以改变某些残基的电荷，导致盐桥的断裂和电荷－电荷排斥，使TCS部分变性成为“融球态”并最终插入磷脂膜。Zhang等［19］研究发现去掉TCS C端的7个氨基酸残基会降低TCS的膜插入能力，表明TCS的C末端对其膜内转位是必须的。

　　3.2   受体介导的内吞作用 

　　TCS对于绒癌JAR细胞性具有高度毒性而对肝癌H35细胞系是相对低毒的，表明TCS进入JAR细胞和H35细胞速度不同，并且胞内转运的效能也不同。Chan等［20］研究发现在同一时间进入JAR细胞的TCS的量是进入H35细胞的3倍。其前期的研究［21］发现TCS可以与低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL-receptor related protein ，LRP)和megalin糖蛋白相互作用，且这种相互作用可被受体相关蛋白（receptor  associated protein, RAP)所抑制。JAR细胞膜富含低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP)，RAP可抑制JAR细胞对TCS的摄取，表明TCS进入JAR细胞的内化作用是由LDL受体家族介导的。

　　Christensen等［22］的研究表明Megalin亦参与介导了TCS的内吞作用，Megalin是肾小管近端起主要重吸收作用的糖蛋白，因而高浓度的TCS对肾脏有一定毒性，能够损伤肾脏的近曲小管。

4   小结和展望

    作为一种从植物根部提纯出来的中药单品，天花粉蛋白因其具有妊娠引产、抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等多种生物学活性而倍受关注，前期的大量工作致力于研究天花粉蛋白的基因序列及空间结构，阐明天花粉蛋白如何进入细胞发挥其生物学效应，已取得一系列重要成果。目前尚有一些问题有待解决，如天花粉蛋白的RNA-N-糖苷酶活性与引产活性和抗HIV活性有何关系？其抗HIV的具体机制是什么? 如何优化或修饰天花粉蛋白的分子结构，提高其生物学活性而降低其过敏原性，并延长天花粉蛋白在体内的半衰期？神州三号飞船进行太空试验时携带了两个能产生天花粉蛋白抗体的细胞株，深入研究上述问题将为天花粉蛋白提供更广阔的应用前景。

【参考文献】
  　　［1］Wang Yu,Qian RQ,GU ZW,et al.Scirntific evaluation of Tian Hua Fen(THF)-history,chemistry and aplication ［J］. Pure ans Appl Chem,1986,58（1）:789.

　　［2］Zhou H, Jiao Z, Pan J, et al. Immune suppression via IL-4/IL-10-secreting T cells: A nontoxic property of anti-HIV agent Trichosanthin［J］. Clin Immunol., 2008,122 (3):312.