HPLC法测定大黄虫片中芍药苷的含量
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发布者：罗国琼,黄斌,蒋荣珍,黄丽鑫
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时间：2011年5月05日 14:32
【摘要】 目的 建立高效液相色谱法测定大黄?虫片中芍药苷含量的方法。方法 选用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)为流动相,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为230 nm。结果 芍药苷在0.10～0.90 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系,r＝0.999 7,平均加样回收率为99.98%,RSD＝0.81%(n＝6)。结论 本法操作简便,准确,重复性好,精密度高,可用于大黄?虫片的质量控制。
护理论文发表
【关键词】 大黄?虫片；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a HPLC method for determining the content of paeoniflorin in Dahuang Zhechong Tablets. Methods Stationary phase was C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), mobile phase was acetonitrice-0.1% phosphoric (14∶86), detection wavelength was 230 nm, flow rate was 1.0 mL/min and column temperature was 30 ℃. Results There was good linear relationship between the concentration of paeoniflorin and area integral value in the range of 0.10～0.90 μg, r＝0.999 7. The average recovery was 99.98% with RSD＝0.81% (n＝6). Conclusion This method is simple, accurate, with good reproducibility and high precision, and can be used to control the quality of Dahuang Zhechong Tablets effectively.
Key words：Dahuang Zhechong Tablets；paeoniflorin；HPLC；content determination
大黄?虫片由熟大黄、土鳖虫、水蛭、白芍等12味中药组成,具有活血破瘀、通经消痞功效,用于瘀血内停,腹部肿块,肌肤甲错,目眶黯黑,潮热羸瘦,经闭不行。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定大黄?虫片中芍药苷的含量,可更好地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪：G1311A四元泵, G1313A自动进样器,G1379A脱气机,G1314VWD检测器, Agilent1100化学工作站；UV-2201型紫外-可见分光光度仪； BUG40型超声波清洗发生器。
大黄?虫片及不含白芍药材的阴性对照品(广西玉林制药有限责任公司技术中心提供)；芍药苷对照品(批号110736- 200628,供含量测定用,中国药品生物制品检定所提供)。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)[1],流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为230 nm,进样量为10 μL。
护理论文发表
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含芍药苷40 μg的溶液,作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品20片,研细,精密称取2 g,置锥形瓶中,加稀乙醇50 mL,超声提取(功率220 W,频率50 Hz) 40 min,放冷,过滤,蒸干。残渣加稀乙醇适量使溶解,通过中性氧化铝柱(100～200目,4 g,内径15 mm),以稀乙醇洗脱,收集洗液50 mL,蒸干,残渣用稀乙醇溶解,并转移至20 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例和工艺,制成不含白芍药材的阴性对照品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液并测定。
2.3 空白试验
按上述色谱条件,吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪进行测定。在与对照品色谱相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。
2.4 线性关系考察护理论文发表
精密称取芍药苷对照品,加甲醇制成浓度分别为10.0、20.0、30.0、40.0、60.0、90.0 μg/mL的系列溶液,分别进样10 μL,在上述色谱条件下测定峰面积。以芍药苷的进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：Y＝
2 437.0X＋35.1,r＝0.999 7,表明芍药苷进样量在0.10～0.90 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取芍药苷对照品溶液(40 μg/mL)10 μL,按上述色谱条件,分别连续进样6次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 036.86,RSD＝0.91%,表明本法精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,按上述色谱条件进行测定。结果芍药苷含量的平均值为0.292 3 mg/片,RSD＝1.68%。表明本法的重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件,分别在0、2、4、6、8、10 h进样1次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 238.26,RSD＝1.45%。表明供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的同批号(批号为860003,含量0.291 mg/片)样品约1 g,精密称取6份,分别精密加入芍药苷对照品适量,按供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算。结果芍药苷的平均回收率为99.98%,RSD＝0.81%。见表1。表1 加样回收率测定结果（略）
2.9 样品测定
护理论文发表
取样品约2 g,精密称定,照“2.2.2”项下方法制成供试液,精密吸取10 μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以外标法计算样品中芍药苷的含量,结果见表2。表2 芍药苷含量测定结果（略）
3 讨论
芍药苷对照品甲醇溶液在紫外分光光度计扫描下,最大吸收波长为230 nm,故选定230 nm为检测波长。
在供试品溶液的制备中,曾采用甲醇、75%乙醇、稀乙醇作为溶剂,对超声和回流提取进行了比较试验。结果表明,采用稀乙醇超声提取与采用稀乙醇回流,测得的含量高且一致,但超声处理方法简单快速,故选用稀乙醇超声处理直接提取样品。同时进行了超声提取时间的考察,分别超声30、40、50、60 min,结果超声40 min可基本提取完全。在用稀乙醇洗脱时,曾收集洗液40、50、60、80 mL进行比较试验,测得的含量表明,收集洗液50 mL已洗脱完全。
本试验曾使用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同比例作流动相进行测定,结果表明,以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)作流动相,芍药苷峰与其他杂质峰较好分离。
本试验采用HPLC法对大黄?虫片中芍药苷进行了含量测定,方法简单,易于操作,分离效果好。
【参考文献】护理论文发表
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.68－69.
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【关键词】 大黄?虫片；芍药苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a HPLC method for determining the content of paeoniflorin in Dahuang Zhechong Tablets. Methods Stationary phase was C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), mobile phase was acetonitrice-0.1% phosphoric (14∶86), detection wavelength was 230 nm, flow rate was 1.0 mL/min and column temperature was 30 ℃. Results There was good linear relationship between the concentration of paeoniflorin and area integral value in the range of 0.10～0.90 μg, r＝0.999 7. The average recovery was 99.98% with RSD＝0.81% (n＝6). Conclusion This method is simple, accurate, with good reproducibility and high precision, and can be used to control the quality of Dahuang Zhechong Tablets effectively.
Key words：Dahuang Zhechong Tablets；paeoniflorin；HPLC；content determination
大黄?虫片由熟大黄、土鳖虫、水蛭、白芍等12味中药组成,具有活血破瘀、通经消痞功效,用于瘀血内停,腹部肿块,肌肤甲错,目眶黯黑,潮热羸瘦,经闭不行。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定大黄?虫片中芍药苷的含量,可更好地控制该制剂的质量。
1 仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪：G1311A四元泵, G1313A自动进样器,G1379A脱气机,G1314VWD检测器, Agilent1100化学工作站；UV-2201型紫外-可见分光光度仪； BUG40型超声波清洗发生器。
大黄?虫片及不含白芍药材的阴性对照品(广西玉林制药有限责任公司技术中心提供)；芍药苷对照品(批号110736- 200628,供含量测定用,中国药品生物制品检定所提供)。乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)[1],流速1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长为230 nm,进样量为10 μL。
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2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取芍药苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含芍药苷40 μg的溶液,作为对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品20片,研细,精密称取2 g,置锥形瓶中,加稀乙醇50 mL,超声提取(功率220 W,频率50 Hz) 40 min,放冷,过滤,蒸干。残渣加稀乙醇适量使溶解,通过中性氧化铝柱(100～200目,4 g,内径15 mm),以稀乙醇洗脱,收集洗液50 mL,蒸干,残渣用稀乙醇溶解,并转移至20 mL量瓶中,用稀乙醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例和工艺,制成不含白芍药材的阴性对照品,按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液并测定。
2.3 空白试验
按上述色谱条件,吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,分别注入液相色谱仪进行测定。在与对照品色谱相应的位置上,供试品溶液具有相同保留时间的色谱峰,而阴性对照在此保留时间无干扰(见图1)。
2.4 线性关系考察护理论文发表
精密称取芍药苷对照品,加甲醇制成浓度分别为10.0、20.0、30.0、40.0、60.0、90.0 μg/mL的系列溶液,分别进样10 μL,在上述色谱条件下测定峰面积。以芍药苷的进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：Y＝
2 437.0X＋35.1,r＝0.999 7,表明芍药苷进样量在0.10～0.90 μg范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
精密吸取芍药苷对照品溶液(40 μg/mL)10 μL,按上述色谱条件,分别连续进样6次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 036.86,RSD＝0.91%,表明本法精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,按上述色谱条件进行测定。结果芍药苷含量的平均值为0.292 3 mg/片,RSD＝1.68%。表明本法的重复性良好。
2.7 稳定性试验
取同一批号(批号为860003)样品,按供试品溶液制备方法制备,按上述色谱条件,分别在0、2、4、6、8、10 h进样1次,测定峰面积,结果芍药苷峰面积的平均值为1 238.26,RSD＝1.45%。表明供试品溶液在10 h内基本稳定。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的同批号(批号为860003,含量0.291 mg/片)样品约1 g,精密称取6份,分别精密加入芍药苷对照品适量,按供试品溶液制备方法制成供试品溶液,按上述色谱条件测定,计算。结果芍药苷的平均回收率为99.98%,RSD＝0.81%。见表1。表1 加样回收率测定结果（略）
2.9 样品测定
护理论文发表
取样品约2 g,精密称定,照“2.2.2”项下方法制成供试液,精密吸取10 μL注入液相色谱仪,按上述色谱条件测定,以外标法计算样品中芍药苷的含量,结果见表2。表2 芍药苷含量测定结果（略）
3 讨论
芍药苷对照品甲醇溶液在紫外分光光度计扫描下,最大吸收波长为230 nm,故选定230 nm为检测波长。
在供试品溶液的制备中,曾采用甲醇、75%乙醇、稀乙醇作为溶剂,对超声和回流提取进行了比较试验。结果表明,采用稀乙醇超声提取与采用稀乙醇回流,测得的含量高且一致,但超声处理方法简单快速,故选用稀乙醇超声处理直接提取样品。同时进行了超声提取时间的考察,分别超声30、40、50、60 min,结果超声40 min可基本提取完全。在用稀乙醇洗脱时,曾收集洗液40、50、60、80 mL进行比较试验,测得的含量表明,收集洗液50 mL已洗脱完全。
本试验曾使用乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同比例作流动相进行测定,结果表明,以乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)作流动相,芍药苷峰与其他杂质峰较好分离。
本试验采用HPLC法对大黄?虫片中芍药苷进行了含量测定,方法简单,易于操作,分离效果好。
【参考文献】护理论文发表
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.68－69.
