CTLA?4基因多态性与粤西汉族人Graves病发病的相关性研究
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时间：2011年3月22日 15:57
【摘要】 目的 研究细胞毒性T淋巴细胞相关抗原?4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen?4,CTLA?4)基因外显子1+49A/G位点和启动子?318位点多态性与粤西汉族人Graves病(GD)发病的关联性。方法 应用PCR?RFLP分析102例GD患者与100例正常对照组CTLA?4基因的外显子1+49位点A/G及启动子?318位点C/T多态性。结果 GD组外显子1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P<0.05)，GD组有家族史者外显子1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于GD组无家族史者(P<0.01);GD组启动子?318位点的各基因型、等位基因频率均与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CTLA?4基因外显子1+49A/G位点GG基因型及G等位基因可能是粤西汉族人GD的易感因素，尤以具有家族史的易感性更明显;启动子?318位点多态性与粤西汉族人GD的遗传易感性无关联。发表论文网
【关键词】 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原?4;格雷夫斯病;多态现象;遗传
Abstract:Objective To investigate the relationships between exon 1 (+49A/G), promoter (?318T/C) polymorphism of CTLA?4 gene and Graves' disease (GD) in Han population in western region of Guangdong province.Methods The exon 1 (+49A/G) and promoter (?318T/C) polymorphism of CTLA?4 gene was detected by PCR?RFLP in 102 GD patients and 100 healthy controls.Results The frequency of GG genotype and G allele of CTLA?4 gene exon 1 (+49 A/G) in GD patients and those with family history was significantly higher than that in control subjects and GD patients without family history (P<0.01 or 0.05), but there was no statistical difference in the distribution of genotype and allele of promoter (?318C/T) between GD and control groups (P>0.05).Conclusion The predisposing factors of GD patients in western region of Guangdong province could be related to GG genotype and G allele of CTLA?4 gene exon 1 (+49 A/G) other than promoter (?318T/C) polymorphism, especially in those with family history.
Key words: cytotoxic T?lymphocyte associated antigen?4 (CTLA?4); Graves' disease; polymorphism; genetics
CTLA?4基因的编码产物CTLA?4是与自身免疫疾病有关的代表标志分子，被认为是Graves病(Graves'disease,GD) 的遗传候选基因，其与HLA基因各占GD遗传易感性的50%[1]。但其与GD的遗传易感性在不同地区、人种的研究结论并不一致[2?3]。为此，本研究对CTLA?4基因外显子1+49 A/G和启动子?318位点多态性与粤西汉族人GD遗传易感的关系作一研究。
1 对象和方法
1.1 对象发表论文网
收集2006年1月至6月广东医学院附属医院内分泌专科门诊及住院的GD患者102例(男23例，女79例)，年龄(44.17±1.54)岁，其中有GD家族史37例(男8例，女29例)，GD患者均根据病史、临床症状、体征、甲状腺功能检查得以确诊。从广东医学院附属医院体检健康人群中100例作为正常组，其中男22例，女78例;年龄 (44.20±1.46)岁，无甲状腺疾病及其他自身免疫性疾病。以上人群均无亲缘关系，祖籍是粤西地区，三代均为汉族。
1.2 方法
所有观察对象抽取外周静脉血，取1mL置于EDTA抗凝试管，用血液基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取白细胞DNA，采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction fragment length polymorphism, PCR?RFLP)方法进行检测。 引物设计与合成：根据GenBank中的CTLA?4 DNA序列设计两对PCR引物，外显子1+49 A/G多态性上游引物5'?GCTCTACTTCCTGAAGACCT?3'，下游引物5'?AGTCTCACTCACCTTTGCAG?3'。启动子 ?318C/T多态性上游引物5'?AAATGAATTGGACTGGATGGT?3’，下游引物 5'?TTACGAGAAAGGAAGCCGTG?3'。取目的基因10μL行PCR扩增反应，再经BbvⅠ内切酶处理后行3%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统扫描。
1.3 统计学处理
以Hardy-Weinberg平衡检验分析研究样本的群体代表性，采用直接计数法计算各组基因型、等位基因数目及频率，计数资料采用χ2检验，计算优势比(OR)及OR值95%可信区间(95%CI)。显著性检验水准为0.05。
2 结果
2.1 各组样本基因型分布
均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。
2.2 基因型判定
外显子1的 PCR扩增片段为162bp，酶切结果为：AA基因型为162bp一个片段，AG基因型为162、88、74bp三个片段，GG基因型为88、74bp两个片段，见图1。启动子PCR扩增片段为226bp，酶切结果为：CC基因型为226bp一个片段，CT基因型为226、130、96bp三个片段，TT 基因型为130、96bp二个片段，见图2。
2.3 CTLA?4基因外显子1+49位点A/G多态性分布
GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P<0.05，OR=2.51, 95%CI 1.20～5.24; P<0.01，OR=1.89，95%CI 1.26～2.84)，GD组有家族史者外显子1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于GD组无家族史者 (P<0.01，OR=6.76,95% CI 2.65～17.24;P<0.01,OR=2.93,95%CI 1.62～5.29)。详见表1。发表论文网
2.4 CTLA?4基因启动子?318位点C/T多态性分布
TT基因型在正常组中例数为1，理论频数很低，将TT及CT组合并。GD组启动子?318位点的各基因型、等位基因频率以及是否有家族史者与正常组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。表1 GD组与正常组CTLA?4基因外显子1+49位点多态性分布与正常组比较：*P<0.05;与无家族史者比较：△P<0.01。表2 GD组与正常组CTLA?4基因启动子?318位点多态性分布与正常组比较：*P>0.05;与无家族史者比较：△P>0.05。
3 讨论
CTLA?4基因多态性是从基因表达调控角度影响CTLA?4分子功能及分子水平。其外显子1 +49A/G位点A/G多态性决定了前导序列的蛋白质糖基化效率，从而影响前导序列的翻译后修饰作用[4?5]。Chis?tiakov等[6]研究发现外显子1第17密码子49位点A/G的二态性导致苏氨酸/丙氨酸的交换可影响前导链的构象，使之不能正确引导细胞内CTLA?4分子的运输，使细胞表面 CTLA?4分子减少。有研究进一步发现，CTLA?4基因外显子1+49A/G位点为A或启动子?318位点为T的人群，其CTLA?4分子表达水平在受到刺激后及CTLA?4 mRNA的表达水平在不刺激状态时均较高[7]。Han等[8]研究认为CTLA?4启动子?318位点为T时的启动子活性较高，可以上调CTLA?4分子的表达水平。
由于遗传易感基因受到种族和环境的影响，CTLA?4基因外显子1+49 A/G位点和启动子?318位点C/T多态性与GD的遗传易感性在不同的地域、种族、年龄阶段不一致。Esteghamati等[4]研究发现意大利GD 患者CTLA?4基因外显子1+49A/G等位基因G的频率较正常组高，差异有统计学意义;伊朗GD患者CTLA?4启动子?318位点C/T基因多态性与GD无关联性。Braun等[9]则认为CTLA?4基因启动子的多态性与GD的相关性是由于启动子与外显子1存在连锁不平衡，因此它只是GD的一个遗传危险标志，但不具有独立易感作用。在本实验中，GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P<0.05)，GD组有家族史者外显子 1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于GD组无家族史者(P<0.01);而启动子?318位点的各基因型、等位基因频率在是否有家族史的GD组与正常组相比均无统计学意义。这提示了CTLA?4基因外显子1+49A/G位点GG基因型及G等位基因可能是粤西汉族人GD的易感因素，尤以具有家族史的易感性更明显;启动子?318位点多态性与粤西汉族人GD的遗传易感性无关联。
通过本实验，我们认为使用基因替代的方法以同源重组方式将保护基因取代易感基因，或者使用免疫基因治疗将融合蛋白CTLA?4Ig阻断协同刺激信号途径以选择性抑制T细胞活化阶段，有可能减少GD等自身免疫性疾病的发病风险。
【参考文献】发表论文网
[1]Zeitlin A A, Heward J M, Newby P R, et al. Analysis of HLA class II genes in Hashimoto's thyroiditis reveals diffe?rences compared to Graves' disease [J]. Genes Immun, 2008，9(4):358?363.
[2]Akaishi P M, Cruz A A, Silva F L,et al. The role of major histocompatibility complex alleles in the susceptibility of Brazi?lian patients to develop the myogenic type of Graves' orbitopathy [J]. Thyroid, 2008，18(4):443?447.
[3]Sasaki M, Yuzawa M, Saito T,et al. New HLA DRB1 and DQB1 haplotypes in a pedigree of familial Graves' disease in Japan [J]. Endocr J，2007，54(5):721?725.
[4]Esteghamati A, Khalilzadeh O, Mobarra Z, et al. Association of CTLA?4 gene polymorphism with Graves' disease and ophthalmopathy in Iranian patients [J]. Eur J Intern Med，2009，20(4):424?428.
[5]Tanrikulu S, Erbil Y, Ademoglu E,et al. The predictive value of CTLA?4 and Tg polymorphisms in the recurrence of Graves' disease after antithyroid withdrawal [J]. Endocrine， 2006，30(3):377?381.
[6]Kavvoura F K, Akamizu T, Awata T, et al. Cytotoxic T?lymphocyte associated antigen 4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid disease: a meta?analysis[J]. J Clin Endocrinol Metab，2007，92(8):3162?3170.
[7] Simmonds M J,Gough S C.Unravelling the genetic complexity of autoimmune thyroid disease:HLA,CTLA?4 and beyond[J].Clin Exp Immunol,2004, 136(1): 1?10.
[8]Han S Z, Zhang S H, Li R, et al. The common ?318C/T polymorphism in the promoter region of CTLA4 gene is asso?ciated with reduced risk of ophthalmopathy in Chinese Graves' patients [J]. Int J Immunogenet，2006，33(4):281?287.
[9]Braun J,Donner H,Sieqmund T,et al. CTLA?4 promoter va?riants in patients with Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis[J].Tissue Antigens, 1998,51 (5):563?566.发表论文网
【关键词】 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原?4;格雷夫斯病;多态现象;遗传
Abstract:Objective To investigate the relationships between exon 1 (+49A/G), promoter (?318T/C) polymorphism of CTLA?4 gene and Graves' disease (GD) in Han population in western region of Guangdong province.Methods The exon 1 (+49A/G) and promoter (?318T/C) polymorphism of CTLA?4 gene was detected by PCR?RFLP in 102 GD patients and 100 healthy controls.Results The frequency of GG genotype and G allele of CTLA?4 gene exon 1 (+49 A/G) in GD patients and those with family history was significantly higher than that in control subjects and GD patients without family history (P<0.01 or 0.05), but there was no statistical difference in the distribution of genotype and allele of promoter (?318C/T) between GD and control groups (P>0.05).Conclusion The predisposing factors of GD patients in western region of Guangdong province could be related to GG genotype and G allele of CTLA?4 gene exon 1 (+49 A/G) other than promoter (?318T/C) polymorphism, especially in those with family history.
Key words: cytotoxic T?lymphocyte associated antigen?4 (CTLA?4); Graves' disease; polymorphism; genetics
CTLA?4基因的编码产物CTLA?4是与自身免疫疾病有关的代表标志分子，被认为是Graves病(Graves'disease,GD) 的遗传候选基因，其与HLA基因各占GD遗传易感性的50%[1]。但其与GD的遗传易感性在不同地区、人种的研究结论并不一致[2?3]。为此，本研究对CTLA?4基因外显子1+49 A/G和启动子?318位点多态性与粤西汉族人GD遗传易感的关系作一研究。
1 对象和方法
1.1 对象发表论文网
收集2006年1月至6月广东医学院附属医院内分泌专科门诊及住院的GD患者102例(男23例，女79例)，年龄(44.17±1.54)岁，其中有GD家族史37例(男8例，女29例)，GD患者均根据病史、临床症状、体征、甲状腺功能检查得以确诊。从广东医学院附属医院体检健康人群中100例作为正常组，其中男22例，女78例;年龄 (44.20±1.46)岁，无甲状腺疾病及其他自身免疫性疾病。以上人群均无亲缘关系，祖籍是粤西地区，三代均为汉族。
1.2 方法
所有观察对象抽取外周静脉血，取1mL置于EDTA抗凝试管，用血液基因组DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取白细胞DNA，采用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction fragment length polymorphism, PCR?RFLP)方法进行检测。 引物设计与合成：根据GenBank中的CTLA?4 DNA序列设计两对PCR引物，外显子1+49 A/G多态性上游引物5'?GCTCTACTTCCTGAAGACCT?3'，下游引物5'?AGTCTCACTCACCTTTGCAG?3'。启动子 ?318C/T多态性上游引物5'?AAATGAATTGGACTGGATGGT?3’，下游引物 5'?TTACGAGAAAGGAAGCCGTG?3'。取目的基因10μL行PCR扩增反应，再经BbvⅠ内切酶处理后行3%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统扫描。
1.3 统计学处理
以Hardy-Weinberg平衡检验分析研究样本的群体代表性，采用直接计数法计算各组基因型、等位基因数目及频率，计数资料采用χ2检验，计算优势比(OR)及OR值95%可信区间(95%CI)。显著性检验水准为0.05。
2 结果
2.1 各组样本基因型分布
均符合Hardy-Weinberg平衡，具有群体代表性。
2.2 基因型判定
外显子1的 PCR扩增片段为162bp，酶切结果为：AA基因型为162bp一个片段，AG基因型为162、88、74bp三个片段，GG基因型为88、74bp两个片段，见图1。启动子PCR扩增片段为226bp，酶切结果为：CC基因型为226bp一个片段，CT基因型为226、130、96bp三个片段，TT 基因型为130、96bp二个片段，见图2。
2.3 CTLA?4基因外显子1+49位点A/G多态性分布
GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P<0.05，OR=2.51, 95%CI 1.20～5.24; P<0.01，OR=1.89，95%CI 1.26～2.84)，GD组有家族史者外显子1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于GD组无家族史者 (P<0.01，OR=6.76,95% CI 2.65～17.24;P<0.01,OR=2.93,95%CI 1.62～5.29)。详见表1。发表论文网
2.4 CTLA?4基因启动子?318位点C/T多态性分布
TT基因型在正常组中例数为1，理论频数很低，将TT及CT组合并。GD组启动子?318位点的各基因型、等位基因频率以及是否有家族史者与正常组相比差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表2。表1 GD组与正常组CTLA?4基因外显子1+49位点多态性分布与正常组比较：*P<0.05;与无家族史者比较：△P<0.01。表2 GD组与正常组CTLA?4基因启动子?318位点多态性分布与正常组比较：*P>0.05;与无家族史者比较：△P>0.05。
3 讨论
CTLA?4基因多态性是从基因表达调控角度影响CTLA?4分子功能及分子水平。其外显子1 +49A/G位点A/G多态性决定了前导序列的蛋白质糖基化效率，从而影响前导序列的翻译后修饰作用[4?5]。Chis?tiakov等[6]研究发现外显子1第17密码子49位点A/G的二态性导致苏氨酸/丙氨酸的交换可影响前导链的构象，使之不能正确引导细胞内CTLA?4分子的运输，使细胞表面 CTLA?4分子减少。有研究进一步发现，CTLA?4基因外显子1+49A/G位点为A或启动子?318位点为T的人群，其CTLA?4分子表达水平在受到刺激后及CTLA?4 mRNA的表达水平在不刺激状态时均较高[7]。Han等[8]研究认为CTLA?4启动子?318位点为T时的启动子活性较高，可以上调CTLA?4分子的表达水平。
由于遗传易感基因受到种族和环境的影响，CTLA?4基因外显子1+49 A/G位点和启动子?318位点C/T多态性与GD的遗传易感性在不同的地域、种族、年龄阶段不一致。Esteghamati等[4]研究发现意大利GD 患者CTLA?4基因外显子1+49A/G等位基因G的频率较正常组高，差异有统计学意义;伊朗GD患者CTLA?4启动子?318位点C/T基因多态性与GD无关联性。Braun等[9]则认为CTLA?4基因启动子的多态性与GD的相关性是由于启动子与外显子1存在连锁不平衡，因此它只是GD的一个遗传危险标志，但不具有独立易感作用。在本实验中，GD组GG基因型及G等位基因频率显著高于正常组(P<0.05)，GD组有家族史者外显子 1+49A/G位点的GG基因型及G等位基因频率显著高于GD组无家族史者(P<0.01);而启动子?318位点的各基因型、等位基因频率在是否有家族史的GD组与正常组相比均无统计学意义。这提示了CTLA?4基因外显子1+49A/G位点GG基因型及G等位基因可能是粤西汉族人GD的易感因素，尤以具有家族史的易感性更明显;启动子?318位点多态性与粤西汉族人GD的遗传易感性无关联。
通过本实验，我们认为使用基因替代的方法以同源重组方式将保护基因取代易感基因，或者使用免疫基因治疗将融合蛋白CTLA?4Ig阻断协同刺激信号途径以选择性抑制T细胞活化阶段，有可能减少GD等自身免疫性疾病的发病风险。
【参考文献】发表论文网
[1]Zeitlin A A, Heward J M, Newby P R, et al. Analysis of HLA class II genes in Hashimoto's thyroiditis reveals diffe?rences compared to Graves' disease [J]. Genes Immun, 2008，9(4):358?363.
[2]Akaishi P M, Cruz A A, Silva F L,et al. The role of major histocompatibility complex alleles in the susceptibility of Brazi?lian patients to develop the myogenic type of Graves' orbitopathy [J]. Thyroid, 2008，18(4):443?447.
[3]Sasaki M, Yuzawa M, Saito T,et al. New HLA DRB1 and DQB1 haplotypes in a pedigree of familial Graves' disease in Japan [J]. Endocr J，2007，54(5):721?725.
[4]Esteghamati A, Khalilzadeh O, Mobarra Z, et al. Association of CTLA?4 gene polymorphism with Graves' disease and ophthalmopathy in Iranian patients [J]. Eur J Intern Med，2009，20(4):424?428.
[5]Tanrikulu S, Erbil Y, Ademoglu E,et al. The predictive value of CTLA?4 and Tg polymorphisms in the recurrence of Graves' disease after antithyroid withdrawal [J]. Endocrine， 2006，30(3):377?381.
[6]Kavvoura F K, Akamizu T, Awata T, et al. Cytotoxic T?lymphocyte associated antigen 4 gene polymorphisms and autoimmune thyroid disease: a meta?analysis[J]. J Clin Endocrinol Metab，2007，92(8):3162?3170.
[7] Simmonds M J,Gough S C.Unravelling the genetic complexity of autoimmune thyroid disease:HLA,CTLA?4 and beyond[J].Clin Exp Immunol,2004, 136(1): 1?10.
[8]Han S Z, Zhang S H, Li R, et al. The common ?318C/T polymorphism in the promoter region of CTLA4 gene is asso?ciated with reduced risk of ophthalmopathy in Chinese Graves' patients [J]. Int J Immunogenet，2006，33(4):281?287.
[9]Braun J,Donner H,Sieqmund T,et al. CTLA?4 promoter va?riants in patients with Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis[J].Tissue Antigens, 1998,51 (5):563?566.发表论文网
