高通量血铜与阿尔茨海默病关系的研究进展液滤过对老年脓毒症患者外周血髓样细胞触发…
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发布者：lunwenchina
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时间：2011年1月14日 09:25
【关键词】 脓毒症;高通量血液滤过;髓样细胞触发受体?1;肿瘤坏死因子?α;白介素?6
脓毒症是由微生物侵入人体而诱发的过度全身炎症反应，老年人(≥60岁)由于其器官老化、功能低下及合并多种慢性疾病，在某些诱因激发下极易发生脓毒性休克和多脏器功能障碍综合征，病死率高达50%〔1〕。近年来，高通量血液滤过(HVHF)在老年脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征治疗中取得显著疗效，但其作用机制仍存较大争议。以往研究主要集中在HVHF对各种致病因子的清除〔2〕，但已有研究证实HVHF治疗脓毒症的效果与清除炎症因子的效率之间无任何关联。髓样细胞触发受体?1(TREM?1)是由Bounchon等〔3〕在2000年新发现的一种免疫球蛋白超家族，是老年感染性疾病中炎症的激发和级联放大的关键介质，能增强炎症反应对机体的影响。因此，笔者观察了HVHF对老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1表达的影响，并对治疗后的老年脓毒症患者外周血单核细胞对内毒素刺激反应性进行观察。
文学论文发表
1 资料与方法
1.1 一般资料 2007年3月至2009年8月收治于绍兴市人民医院ICU 科老年脓毒症患者20例。10例在早期液体复苏、抗感染、强化血糖控制、脏器支持等综合治疗措施基础上，辅以HVHF治疗，男8例，女2例，年龄 54～89(平均71.72±15.32)岁，急性生理和慢性健康(APACHE Ⅱ)评分12.24±3.59;HVHF参数设置：连续性静脉血液滤过(CVVH)前稀释法，通路为股静脉留置双腔导管，血流速度250 ml/min，置换量6 L/h。使用百特BM25血滤机。置换液为南京军区总医院配方。滤器为聚碳酸酯(AN69)膜，24 h更换一次，持续72 h。另10例患者(男8例，女2例，平均年龄72.01±13.57岁，APACHE Ⅱ评分 12.97±3.03)为与HVHF组配对的性别、年龄和APACHE Ⅱ评分相近，因经济原因未能行HVHF治疗而其余治疗措施相同的老年脓毒症患者。10例健康体检老年人作为健康对照。
1.2 入选标准 APACHE II评分≥8分;年龄≥60岁，脓毒症诊断符合：凡临床上具有细菌学证据或高度可疑的感染，并符合以下前四条中的两条即可诊断为脓毒症：①体温>38℃或<35.6℃;②心率>90次/min;呼吸频率>20次/min或需要机械通气;③顽固性低血压(液体复苏 ≥500 ml，收缩压<90 mmHg);④12 h内出现至少以下一个脏器功能不全表现：神志改变;低氧血症(PaO2/FiO2<280);乳酸高于正常水平或代酸;少尿(尿量<0.5 ml·kg-1·h-1);弥漫性血管内凝血(DIC)表现。
文学论文发表
1.3 体外单核细胞培养及处理 HVHF组和配对组治疗72 h后抽取静脉血5 ml，以枸橼酸钠抗凝，用Ficoll?hypzue细胞分离液(美国Pharmacia公司)分离外周血单核细胞。调整细胞数后置于48孔悬浮细胞培养板中，用含10%胎牛血清的RPMI?1640在37℃、5% CO2孵育箱中体外培养。孵育6 h后加入10 U/L内毒素(LPS)(美国BD公司)刺激，在孵育48 h后以1 500 r/min 4℃离心收集上清液，-80℃冰箱保存。另10名健康对照者抽血予同样操作。
1.4 ELISA法测定肿瘤坏死因子(TNF?α)和白介素(IL?6) TNF?α和IL?6 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，实验按照说明书进行。
1.5 RT?PCR检测外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达 HVHF组和配对组治疗0、72 h时相点抽取静脉血5 ml，并以枸橼酸钠抗凝。用Ficoll?hypzue细胞分离液(美国Pharmacia公司)分离外周血单核细胞。用Trizol试剂(美国 GIBCO公司)提取细胞总RNA 。按常规方法建立RT?PCR反应体系和反应条件，采用Promega公司试剂盒，以β?actin的扩增作为内参照，引物序列(TREM?1：正义链：5′?CGG GAT CCT AGT GCA CAG GAA GGA TG?3′，反义链：5′?GCT CTA GAG GAC ATT CTC GTG GGT TCG T?3′;β?actin：正义链：5′?TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A?3′，反义链：5′?CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G?3′)由上海申友公司合成。扩增产物取每个反应体系10 μl于非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳结果与β?actin的电泳结果相对照，采用凝胶图像处理系统(GIS)分析软件定量分析，计算TREM?1与β?actin光密度值。另测定10例健康志愿者。
1.6 统计学分析 测定结果采用SPSS11.5软件包进行统计学处理,数据均用x±s表示，采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 HVHF治疗对老年脓毒症外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达影响 老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达显著高于健康对照(F=17.27，P<0.05)。在治疗前HVHF组与配对组TREM?1 mRNA水平无显著性差异。HVHF组治疗72 h后外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达显著低于配对组(F=13.54，P<0.05)。见表1。文学论文发表
2.2 治疗后老年脓毒症外周血单核细胞对LPS刺激的反应 在体外培养并以LPS刺激的单核细胞中，TNF?α和IL?6分泌水平HVHF组显著低于配对组，但仍高于健康对照组，见表2。表1 各组外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达(x±s)与健康对照组比较：1)P<0.05，与配对组比较：2)P<0.05表2 单核细胞对LPS刺激反应 (pg/ml，x±s)
3 讨 论
脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征是重症医学科内老年人常见的危重症，致死率高达50%。HVHF在老年脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征治疗中取得显著疗效。有学者提出HVHF可能参与重建机体免疫内稳状态〔4〕，新近一些研究亦有证实HVHF可下调单核细胞Toll样受体的表达〔5，6〕，但也有一些好转老年脓毒症患者Toll样受体持续高表达。因此，目前“清除炎症介质”与“下调Toll样受体”学说尚未能完全解释其作用机制。
Bounchon等〔7〕研究发现TREM?1与未知配体结合，在LPS、细菌或真菌的协调刺激下，导致促炎细胞因子如TNF?α、IL?6、巨噬细胞集落刺激因子等和趋化因子如IL?8、单核细胞趋化蛋白?1等的持续分泌，髓过氧化物酶的释放，渗出相关黏附分子的上调;而抑制TREM?1功能，可有效降低血浆TNF?α及IL?1β水平，防止休克和死亡的发生，对腹腔内注射LPS，盲肠结扎或穿刺伤构成的LPS休克小鼠动物模型有明显的保护作用。Bleharski等〔8〕亦进一步证明，TREM?1与未知配体的结合和Toll样受体能协同促进炎症细胞因子的释放，使TNF?α、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)的释放增加5～20倍，同时可抑制抗炎症因子IL?10的释放。Gilob等〔9〕通过siRNA干扰所得 TREM?1基因沉默小鼠细菌性腹膜炎模型的研究发现，TREM?1基因完全沉默时，小鼠对微生物的炎症反应变得迟钝，死亡率增加，但比正常小鼠对致死性 LPS耐受性增加，而TREM?1部分沉默的则显著有益于该模型小鼠的生存。以上研究结果表明，TREM?1在急性炎症中具有重要作用，不可或缺，但过度的炎症反应又对机体具有不利影响。因此，通过任何一种手段调节TREM?1的活性状态，使其维持在适度水平，对于脓毒症的治疗是关键的。
文学论文发表
本研究发现老年脓毒症患者TREM?1 mRNA表达显著高于健康对照，说明 TREM?1可能参与老年脓毒症患者炎症介质的过度活化反应过程。经HVHF治疗72 h，老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1mRNA表达水平显著低于配对组，但仍高于健康对照组。分离外周血单核细胞并分别孵育，以LPS刺激，在 48 h测定上清液炎症介质TNF?α和IL?6水平，结果显示HVHF组炎症介质水平显著低于配对组，但仍高于健康对照，说明TREM?1下调可减少炎症介质的释放。
综合上述，老年脓毒症患者在过度炎性介质释放阶段，免疫细胞表面TREM?1表达显著上调，加剧炎症反应。HVHF可能通过清除大量炎症介质，稳定内环境，从而反馈调节单核细胞TREM?1水平，使其维持在适度水平，即能产生一定炎症介质，使机体对感染源保持相应炎症反应活性，而又非过度激活状态。
【参考文献】
1 尹永杰，赵淑杰，王奭骥，等.生脉注射液治疗老年脓毒性休克的疗效分析〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(18)：1788?90.
2 Klouche K，Cavadore P，Portales P，et al.Continuous veno?venous hemofiltration improves hemodynamics in septic shock with acute renal failure without modifying TNF?α and IL?6 plasma concentrations〔J〕.J Nephrol，2002;15(2):150?7.
3 Bounchon A，Dietrich J，Colonna M.Cutting edge：inflammatory responses can be triggered by TREM?1，a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes〔J〕.J Immunol，2000;164(10)：4991?5.
4 余 晨，刘志红，郭啸华，等.连续性血液净化治疗全身炎症反应综合征及脓毒症对机体免疫功能的影响〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2003;12(1)：2?9.
文学论文发表
5 王少东，张杏泉，吴学豪，等.CRRT对严重脓毒症患者单核细胞TLR4表达的调节〔J〕.世界急危重病医学杂志，2007;4(4)：1925?8.
6 茅尧生，吕 铁，郑建鹏.不同置换量血液滤过对脓毒症患者Toll样受体影响〔J〕.中华急诊医学杂志.2009;18(10)：1047?51.
7 Bounchon A，Facchetu F，Weigand MA，et al.TREM?1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock〔J〕.Nature，2001;41D(6832)：1103?7.
8 Bleharski JR， Kiessler V，Buonsanti C，et al.A role for triggering receptor expressed on myeloid cells?1 in host defense during the early induced and adaptive phases of the immume response〔J〕.J Immunol，2003;179(7)：3812?8.
9 Gilob S，Massin F，Marcou M，et al.TREM?1 promotes survival during septic shock in mice〔J〕.Eur J Immunol，2007;37(2)：456?66.
脓毒症是由微生物侵入人体而诱发的过度全身炎症反应，老年人(≥60岁)由于其器官老化、功能低下及合并多种慢性疾病，在某些诱因激发下极易发生脓毒性休克和多脏器功能障碍综合征，病死率高达50%〔1〕。近年来，高通量血液滤过(HVHF)在老年脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征治疗中取得显著疗效，但其作用机制仍存较大争议。以往研究主要集中在HVHF对各种致病因子的清除〔2〕，但已有研究证实HVHF治疗脓毒症的效果与清除炎症因子的效率之间无任何关联。髓样细胞触发受体?1(TREM?1)是由Bounchon等〔3〕在2000年新发现的一种免疫球蛋白超家族，是老年感染性疾病中炎症的激发和级联放大的关键介质，能增强炎症反应对机体的影响。因此，笔者观察了HVHF对老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1表达的影响，并对治疗后的老年脓毒症患者外周血单核细胞对内毒素刺激反应性进行观察。
文学论文发表
1 资料与方法
1.1 一般资料 2007年3月至2009年8月收治于绍兴市人民医院ICU 科老年脓毒症患者20例。10例在早期液体复苏、抗感染、强化血糖控制、脏器支持等综合治疗措施基础上，辅以HVHF治疗，男8例，女2例，年龄 54～89(平均71.72±15.32)岁，急性生理和慢性健康(APACHE Ⅱ)评分12.24±3.59;HVHF参数设置：连续性静脉血液滤过(CVVH)前稀释法，通路为股静脉留置双腔导管，血流速度250 ml/min，置换量6 L/h。使用百特BM25血滤机。置换液为南京军区总医院配方。滤器为聚碳酸酯(AN69)膜，24 h更换一次，持续72 h。另10例患者(男8例，女2例，平均年龄72.01±13.57岁，APACHE Ⅱ评分 12.97±3.03)为与HVHF组配对的性别、年龄和APACHE Ⅱ评分相近，因经济原因未能行HVHF治疗而其余治疗措施相同的老年脓毒症患者。10例健康体检老年人作为健康对照。
1.2 入选标准 APACHE II评分≥8分;年龄≥60岁，脓毒症诊断符合：凡临床上具有细菌学证据或高度可疑的感染，并符合以下前四条中的两条即可诊断为脓毒症：①体温>38℃或<35.6℃;②心率>90次/min;呼吸频率>20次/min或需要机械通气;③顽固性低血压(液体复苏 ≥500 ml，收缩压<90 mmHg);④12 h内出现至少以下一个脏器功能不全表现：神志改变;低氧血症(PaO2/FiO2<280);乳酸高于正常水平或代酸;少尿(尿量<0.5 ml·kg-1·h-1);弥漫性血管内凝血(DIC)表现。
文学论文发表
1.3 体外单核细胞培养及处理 HVHF组和配对组治疗72 h后抽取静脉血5 ml，以枸橼酸钠抗凝，用Ficoll?hypzue细胞分离液(美国Pharmacia公司)分离外周血单核细胞。调整细胞数后置于48孔悬浮细胞培养板中，用含10%胎牛血清的RPMI?1640在37℃、5% CO2孵育箱中体外培养。孵育6 h后加入10 U/L内毒素(LPS)(美国BD公司)刺激，在孵育48 h后以1 500 r/min 4℃离心收集上清液，-80℃冰箱保存。另10名健康对照者抽血予同样操作。
1.4 ELISA法测定肿瘤坏死因子(TNF?α)和白介素(IL?6) TNF?α和IL?6 ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，实验按照说明书进行。
1.5 RT?PCR检测外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达 HVHF组和配对组治疗0、72 h时相点抽取静脉血5 ml，并以枸橼酸钠抗凝。用Ficoll?hypzue细胞分离液(美国Pharmacia公司)分离外周血单核细胞。用Trizol试剂(美国 GIBCO公司)提取细胞总RNA 。按常规方法建立RT?PCR反应体系和反应条件，采用Promega公司试剂盒，以β?actin的扩增作为内参照，引物序列(TREM?1：正义链：5′?CGG GAT CCT AGT GCA CAG GAA GGA TG?3′，反义链：5′?GCT CTA GAG GAC ATT CTC GTG GGT TCG T?3′;β?actin：正义链：5′?TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ACG A?3′，反义链：5′?CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G?3′)由上海申友公司合成。扩增产物取每个反应体系10 μl于非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，电泳结果与β?actin的电泳结果相对照，采用凝胶图像处理系统(GIS)分析软件定量分析，计算TREM?1与β?actin光密度值。另测定10例健康志愿者。
1.6 统计学分析 测定结果采用SPSS11.5软件包进行统计学处理,数据均用x±s表示，采用单因素方差分析。
2 结 果
2.1 HVHF治疗对老年脓毒症外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达影响 老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达显著高于健康对照(F=17.27，P<0.05)。在治疗前HVHF组与配对组TREM?1 mRNA水平无显著性差异。HVHF组治疗72 h后外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达显著低于配对组(F=13.54，P<0.05)。见表1。文学论文发表
2.2 治疗后老年脓毒症外周血单核细胞对LPS刺激的反应 在体外培养并以LPS刺激的单核细胞中，TNF?α和IL?6分泌水平HVHF组显著低于配对组，但仍高于健康对照组，见表2。表1 各组外周血单核细胞TREM?1 mRNA表达(x±s)与健康对照组比较：1)P<0.05，与配对组比较：2)P<0.05表2 单核细胞对LPS刺激反应 (pg/ml，x±s)
3 讨 论
脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征是重症医学科内老年人常见的危重症，致死率高达50%。HVHF在老年脓毒症、脓毒性休克、多脏器功能障碍综合征治疗中取得显著疗效。有学者提出HVHF可能参与重建机体免疫内稳状态〔4〕，新近一些研究亦有证实HVHF可下调单核细胞Toll样受体的表达〔5，6〕，但也有一些好转老年脓毒症患者Toll样受体持续高表达。因此，目前“清除炎症介质”与“下调Toll样受体”学说尚未能完全解释其作用机制。
Bounchon等〔7〕研究发现TREM?1与未知配体结合，在LPS、细菌或真菌的协调刺激下，导致促炎细胞因子如TNF?α、IL?6、巨噬细胞集落刺激因子等和趋化因子如IL?8、单核细胞趋化蛋白?1等的持续分泌，髓过氧化物酶的释放，渗出相关黏附分子的上调;而抑制TREM?1功能，可有效降低血浆TNF?α及IL?1β水平，防止休克和死亡的发生，对腹腔内注射LPS，盲肠结扎或穿刺伤构成的LPS休克小鼠动物模型有明显的保护作用。Bleharski等〔8〕亦进一步证明，TREM?1与未知配体的结合和Toll样受体能协同促进炎症细胞因子的释放，使TNF?α、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM?CSF)的释放增加5～20倍，同时可抑制抗炎症因子IL?10的释放。Gilob等〔9〕通过siRNA干扰所得 TREM?1基因沉默小鼠细菌性腹膜炎模型的研究发现，TREM?1基因完全沉默时，小鼠对微生物的炎症反应变得迟钝，死亡率增加，但比正常小鼠对致死性 LPS耐受性增加，而TREM?1部分沉默的则显著有益于该模型小鼠的生存。以上研究结果表明，TREM?1在急性炎症中具有重要作用，不可或缺，但过度的炎症反应又对机体具有不利影响。因此，通过任何一种手段调节TREM?1的活性状态，使其维持在适度水平，对于脓毒症的治疗是关键的。
文学论文发表
本研究发现老年脓毒症患者TREM?1 mRNA表达显著高于健康对照，说明 TREM?1可能参与老年脓毒症患者炎症介质的过度活化反应过程。经HVHF治疗72 h，老年脓毒症患者外周血单核细胞TREM?1mRNA表达水平显著低于配对组，但仍高于健康对照组。分离外周血单核细胞并分别孵育，以LPS刺激，在 48 h测定上清液炎症介质TNF?α和IL?6水平，结果显示HVHF组炎症介质水平显著低于配对组，但仍高于健康对照，说明TREM?1下调可减少炎症介质的释放。
综合上述，老年脓毒症患者在过度炎性介质释放阶段，免疫细胞表面TREM?1表达显著上调，加剧炎症反应。HVHF可能通过清除大量炎症介质，稳定内环境，从而反馈调节单核细胞TREM?1水平，使其维持在适度水平，即能产生一定炎症介质，使机体对感染源保持相应炎症反应活性，而又非过度激活状态。
【参考文献】
1 尹永杰，赵淑杰，王奭骥，等.生脉注射液治疗老年脓毒性休克的疗效分析〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(18)：1788?90.
2 Klouche K，Cavadore P，Portales P，et al.Continuous veno?venous hemofiltration improves hemodynamics in septic shock with acute renal failure without modifying TNF?α and IL?6 plasma concentrations〔J〕.J Nephrol，2002;15(2):150?7.
3 Bounchon A，Dietrich J，Colonna M.Cutting edge：inflammatory responses can be triggered by TREM?1，a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes〔J〕.J Immunol，2000;164(10)：4991?5.
4 余 晨，刘志红，郭啸华，等.连续性血液净化治疗全身炎症反应综合征及脓毒症对机体免疫功能的影响〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2003;12(1)：2?9.
文学论文发表
5 王少东，张杏泉，吴学豪，等.CRRT对严重脓毒症患者单核细胞TLR4表达的调节〔J〕.世界急危重病医学杂志，2007;4(4)：1925?8.
6 茅尧生，吕 铁，郑建鹏.不同置换量血液滤过对脓毒症患者Toll样受体影响〔J〕.中华急诊医学杂志.2009;18(10)：1047?51.
7 Bounchon A，Facchetu F，Weigand MA，et al.TREM?1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock〔J〕.Nature，2001;41D(6832)：1103?7.
8 Bleharski JR， Kiessler V，Buonsanti C，et al.A role for triggering receptor expressed on myeloid cells?1 in host defense during the early induced and adaptive phases of the immume response〔J〕.J Immunol，2003;179(7)：3812?8.
9 Gilob S，Massin F，Marcou M，et al.TREM?1 promotes survival during septic shock in mice〔J〕.Eur J Immunol，2007;37(2)：456?66.
