通络益肾汤对DN模型大鼠肾组织α-SMA表达影响的实验研究

【摘要】  　　目的观察通络益肾汤对糖尿病肾病（DN）大鼠肾小管上皮及间质平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响，探讨本方对DN模型大鼠肾保护作用的可能机制。方法采用单侧肾切除+STZ诱导DN大鼠模型，大鼠随机分为正常组、病理组、通络益肾汤治疗组、西药治疗组。观察各组大鼠治疗后肾功能（BUN、Scr）、24 h尿蛋白定量（24hUpr）、尿β2微球蛋白（β2-MG）含量、肾脏肥大指数及肾组织α-SMA的表达等指标的变化。结果与病理组比较，通络益肾汤治疗组大鼠肾脏肥大指数、BUN、Scr显著改善（P<0.01），24 h Upr、尿β2-MG明显下降（P<0.01），肾小管上皮及间质α-SMA阳性表达率明显下降（P<0.01），与西药组比较，各项指标无显著性差异（P﹥0.05）。结论通络益肾汤可能通过降低肾小管上皮α-SMA的表达，抑制肾小管上皮-间质细胞转分化，延缓肾小管间质纤维化，从而达到保护肾脏，改善肾功能的目的。

【关键词】  通络益肾汤　 糖尿病肾病　α-平滑肌肌动蛋白

　　糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）发展到一定阶段而出现的主要并发症之一。DN持续、进行性发展，将导致终末期肾脏病(ESRD)。肾间质纤维化是导致ESRD的主要原因和共同病理过程，肾小管上皮-间质细胞转分化（EMT）则是肾间质纤维化的重要发病机制之一［1］，肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）又是EMT的标志因子［2］。此前我们针对DN肾亏阴阳两虚、血络瘀阻的病机，使用通络益肾汤治疗DN，临床取得较好疗效［3］。本实验通过观察通络益肾汤对DN模型大鼠肾小管上皮-间质细胞转分化中α-SMA表达的影响，探讨其对DN肾间质纤维化的影响，揭示其肾保护作用的可能机制。

　　1  材料

　　1.1  动物SD雄性大鼠，60只，体质量(180±20)g，由第四军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(军)2007-007（08034）。

　　1.2  用药及试剂通络益肾汤由桃仁、水蛭、生地、酒大黄、山萸肉、山药、黄芪等组成，大鼠用量按文献折算［4］。药物经常规煎煮、过滤，水浴蒸发至每毫升含生药2.23 g，置于4℃冰箱保存备用。洛汀新：北京诺华制药有限公司生产，批号X1036；糖适平：北京万辉双鹤药业有限责任公司生产，批号070822。链脲佐菌素（STZ）：购自sigma公司，批号S8050。α-SMA试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　2  方法

　　2.1  模型复制及分组给药大鼠购回后适应性喂养1周，称体重，经尿糖、尿蛋白定性检测为阴性后，随机抽取9只作为正常对照组（A组）。所有大鼠以10%水合氯醛 3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉、备皮、常规消毒，在背部左肾区做1～1.5 cm切口，A组仅暴露出左肾，用玻棒拨动后，缝合切口。模型组大鼠暴露左肾，剥离肾脏脂肪及肾上腺，结扎左肾门血管，切除左肾，缝合切口。碘伏消毒，红霉素软膏涂抹创口。术后1周，模型组按50 mg/kg体重腹腔内注射2%STZ溶液，A组腹腔注射等量的枸橼酸钠缓冲液。72h后经尾静脉取血，测空腹血糖高于16.7 mmol/L为DM模型成功。1周后，随机抽取两只测尿微量白蛋白﹥15 μg/ml，确定DN模型形成［5,6］。将造模成功后的43只大鼠随机分为病理组15只（B组），通络益肾汤治疗组14只（C组），西药治疗组14只（D组）。 A 、B组分别给蒸馏水2 ml灌胃， C组给通络益肾汤煎液灌胃（22.3 g/kg）,D组给洛汀新（1.5 mg/kg）＋糖适平（10 mg/kg）蒸馏水混悬液灌胃。以上给药均1次/d，共持续10周。

　　2.2  观测指标及方法24 h Upr、尿β2-MG测定：治疗结束后于处死前1 d，代谢笼收集尿液，检测24 hUpr、尿β2-MG含量；治疗结束后，腹腔麻醉下心脏采血，全自动生化分析仪检测BUN，Scr；大鼠处死后取肾脏称重，计算肾脏肥大指数（肾重KW/体重BW）；摘取右肾，肾组织常规石蜡包埋，切片，按α-SMA试剂盒操作说明，免疫组化法测定α-SMA表达。

　　2.3  资料统计与分析各组数据以±s表示，组间比较采用t检验。所有数据统计学处理运用SPSS13.0进行分析。

　3  结果

　　3.1  治疗后各组大鼠肾功能、肾脏肥大指数的比较结果见表1。表1  各组模型大鼠肾功能、肾脏肥大指数的比较（ 略）

    B组大鼠BUN、Scr、肾脏肥大指数较A组明显增高，均有极显著性差异（P<0.01）；与B组比较，C组、D组大鼠BUN、Scr、肾脏肥大指数明显降低，具有极显著性差异（P<0.01）。C、D两组比较，上述指标无明显差异（P＞0.05）。说明通络益肾汤和西药治疗在改善DN大鼠肾脏肥大指数、肾功能方面有都有比较理想的疗效，两者之间无显著性差异。

　　3.2  治疗后各组大鼠24hUpr、尿β2-MG含量比较结果见表2。表2  各组模型大鼠24 h Upr、β2-MG含量（ 略）

    B组大鼠24hUpr、β2-MG含量较A组明显升高，有极显著性差异（P<0.01）；C组、D组与B组比较，24hUpr、β2-MG含量均有明显降低，具有极显著性差异（P<0.01）。C组与D组比较，两者无明显差异（P＞0.05）。说明通络益肾汤和西药治疗均有降低24hUpr、β2-MG含量的作用，且疗效相当。

　　3.3  各组大鼠肾脏组织α-SMA的表达免疫组化阳性表达分析，每组样本按顺序观察9个视野 ,采PHOTOSHOP图像处理软件计算小管间质免疫组化检测阳性面积和小管间质总面积的比值,取 9个比值的均值作为每组实验大鼠α-SMA的测定值。结果见表3。表3  各组大鼠肾组织α-SMA的比较（ 略）

　　4  讨论

    肾间质纤维化主要表现为肾脏固有细胞消失、肌成纤维细胞增多、细胞外基质沉积等［7］。糖尿病肾病是慢性发展过程，目前研究表明，慢性肾脏疾病肾功能的恶化趋势主要决定于肾小管间质纤维化(TIF)的程度和范围。在TIF过程中,肾小管基底膜被破坏的同时常伴有肾小管上皮细胞向肌纤维母细胞样细胞转分化，称之为肾小管上皮-间质细胞转分化（EMT），继之出现间质区细胞外基质( ECM)大量产生和沉积,导致间质区扩展加宽,肾小管萎缩,形成 TIF。另有资料显示,肾脏病时肾间质中的成纤维细胞大部分都是通过 EMT由肾小管上皮细胞(RTEC)转化而来的,且在基因鼠模型中,选择性阻断 EMT可以明显改善梗阻性肾病所致的TIF。因此,EMT现象已日益被认为是 TIF形成和进展过程中的重要环节［1］。现代研究发现α-SMA是肾小管上皮细胞转化和肾间质纤维化程度的重要指标［2］。研究发现人肾组织中肾小管间质内α-SMA表达量与肾小管间质纤维化程度及肾功能恶化程度正相关［8］。李暖等［9］动物实验研究亦发现腺嘌呤肾小管间质纤维化大鼠模型第7周α-SMA表达已明显增多，第12、17周时α-SMA表达量进一步增加，α-SMA变化与肾病理、肾功能、尿蛋白变化一致，提示随病情进展,α-SMA表达量增加,肾脏病理变化越来越重,促进了肾小管间质纤维化的发生。我们的研究也证实，病理组大鼠肾小管上皮及间质α-SMA的阳性表达率明显高于正常对照组（P<0.01）。

    本课题既往的临床研究证实，通络益肾汤能显著改善DN患者临床症状，能有效地降低或控制DN患者的尿蛋白，降低血糖、血脂，改善患者的肾功能（BUN、Scr）；还能显著改善DN患者的部分血液流变学指标，对DN患者具有确切的治疗效果［3］。实验研究发现，该方能明显升高DN模型大鼠血浆NO水平，显著降低其血浆ET的含量［6,10］ 。

    本实验结果显示,通络益肾汤能有效改善DN模型大鼠肾脏肥大指数、肾功能，降低24hUpr、尿β2-MG含量，对DN模型大鼠有良好的治疗效果。这一结果再次证实通络益肾汤的疗效，也验证了我们此前的研究。同时发现经本方治疗后，DN模型大鼠肾小管间质α-SMA表达率较病理组明显下降；观察肾脏病理变化发现，肾间质纤维化程度明显减轻。提示通络益肾汤有效治疗DN的机理与有效降低肾小管上皮及间质α-SMA的阳性表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，延缓肾小管间质纤维化有关，从而达到保护肾脏组织，改善和恢复肾功能之目的。

【参考文献】
  　　［1］熊璟，李航，周全荣，等. 中医药对肾小管上皮- 间充质转变作用的干预研究概况［J］.中国中西医结合肾病杂志，2006，7 (12)：743.

　　［2］王瑞英,姚 敏,王 棉,等.2型糖尿病大鼠肾小管上皮细胞中α-SMA的表达及其与肾功能的关系［J］.中国老年学杂志,2006，26（5）：647.

　　［3］董正华,曹广顺,曹 雯，等.通络益肾汤治疗糖尿病肾病30例［J］.上海中医药杂志，2007，41（9）：46.

　　［4］孙敬方.实验动物方法学，第1版［M］.北京：人民出版社，2001：478.

　　［5］邢淑丽,郑君芙,黄文政.单侧肾切除STZ诱导糖尿病肾病大鼠动物模型研究［J］.中国中医急症，2006，15（6）：643.

　　［6］李小会，董正华.通络益肾汤对链脲佐菌素诱导DN大鼠血浆一氧化氮影响的实验研究［J］.时珍国医国药，2006，17（8）：1399.

　　［7］Ng YY,Huang TP,Yang WC,et al. Tubular epithelial-myofibroblasts Transdiff-erentiation in progressive tubuloinstitial fibrosis in 5/6 nephretomizedrats［J］.Kidney Int, 1998，54(3): 864.

　　［8］蒋文功,刘玉华.人类IgA肾病肾小球Ki-67阳性细胞、α-SMA表达的免疫组化研究［J］.广东药学院学报, 2006，22(2): 188.

　　［9］李暖,杨达胜.α－平滑肌肌动蛋白在大鼠肾小管间质纤维化中的表达及意义［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（17）：1311.

　　［10］董正华，李小会.通络益肾汤对链脲佐菌素DN大鼠血浆ET影响的实验研究［J］.陕西中医，2006，27（6）：757.