HPLC法测定复方血竭凝胶中阿魏酸的含量
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发布者：刘超英,刘丹,张小燕,韩建伟
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时间：2011年5月05日 14:25
【摘要】 目的 建立复方血竭凝胶中阿魏酸的含量测定方法。方法 采用高效液相色谱(HPLC)法,色谱柱为ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),以甲醇-0.3%冰醋酸(35∶65)为流动相,检测波长为320 nm,柱温35 ℃,流速1.0 mL/min。结果 阿魏酸在0.031～0.310 μg范围内呈线性关系(r＝0.999 9),平均回收率为95.82%(RSD＝0.63%)。结论 此方法操作简便、可靠,重复性好,专属性强,能有效控制该制剂的质量。
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【关键词】 复方血竭凝胶；阿魏酸；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a method for determination of ferulic acid in Compound Xuejie Gels. Methods HPLC method was carried out on Zorbax SB-C18 (5 μm, 4.6 mm×250 mm), with detection wavelength at 320 nm. The mobile phase was composed of methanol-0.3% aqueous acetic acid (35∶65), the column temperature was 35 ℃ and the flow rate was 1.0 mL/min. Results The calibration curve was linear in the range of 0.031～0.310 μg (r＝0.999 9). The average recovery was 95.82% (RSD＝0.63%). Conclusion This method is simple, accurate, reliable and reproducible, and can be used for the quality control of the preparation.
Key words：Compound Xuejie Gels；Ferulic acid；HPLC；content determination
复方血竭凝胶由延胡索、血竭、乳香、当归、冰片5味中药组成,具有活血散瘀、消肿止痛、生肌止痒的功效。本试验选用阿魏酸作为指标成分,参考有关文献[1],建立了测定其含量的方法。通过方法学考察,本方法稳定性好,专属性强,可作为复方血竭凝胶的质量控制方法之一。
1 仪器与试药
Agilent 1100系列高效液相色谱仪(四元泵,美国)；超声波清洗器(HJ69-10L,北京中西远大科技有限公司)。阿魏酸对照品(批号0726-200208,中国药品生物制品检定所提供)；复方血竭凝胶(本院自制)。甲醇(分析纯,上海振兴化工一厂),其他试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-0.3%冰醋酸(35∶65)；检测波长：320 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min。阿魏酸对照品溶液及供试品溶液均在11 min左右出现特征吸收峰,阴性对照在阿魏酸位置处无干扰。见图1。
2.2 溶液的制备论文发表网
2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取减压干燥48 h的阿魏酸对照品1.55 mg于50 mL量瓶中,加70%甲醇溶解定容,制成1 mL含阿魏酸31 μg的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取复方血竭凝胶约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入HCl-90%甲醇(1∶99)20 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用HCl-90%甲醇(1∶99)补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液5 mL,置分液漏斗中,用乙酸乙酯分次振摇提取4次(10、10、5、5 mL)。合并乙酸乙酯液,水浴蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 mL棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例和制备工艺制备不含当归的阴性样品,按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。
2.3 线性关系及检出限
精密量取“2.2.1”项下对照品储备液0.5、1、2、3、4、5 mL分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件依次进样20 μL,以进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：Y＝3 376.5X－4.078 5,r＝0.999 9,表明阿魏酸在0.031～0.310 μg范围内线性关系良好。同时将对照品溶液稀释后进样,检得最低检测限为5.95 μg/mL。
2.4 精密度试验
吸取阿魏酸对照品溶液10 μL,重复测定6次,RSD＝1.57%。
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2.5 稳定性试验
吸取同一供试品溶液10 μL,分别于0、1、2、4、6、8 h进样,测定峰面积,RSD＝1.90%。表明至少8 h内供试品溶液仍保持稳定。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品6份,按供试品溶液制备方法制备,测定,计算含量分别为0.082 0、0.079 1、0.081 9、0.079 2、0.081 1、0.079 9 mg/g,平均含量为0.080 5 mg/g,RSD＝1.71%。
2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的同批样品6份,分别加入阿魏酸对照品溶液(31 μg/mL)4、5、6 mL各2份,按供试品溶液制备方法制备后,HPLC测定,记录峰面积,计算回收率,结果见表1。表1 回收率试验结果（略）
2.8 样品含量测定
取样品3批,按照供试品溶液制备方法制备后,HPLC测定,结果见表2。表2 复方血竭凝胶3批样品含量测定结果(略)
3 讨论论文发表网
阿魏酸对光热不稳定,因此,在分析过程中样品宜放置于棕色容量瓶并避光保存,且不宜长时间高温加热。
在选择样品处理方法时,本试验对比了4种提取溶剂：甲醇、HCl-甲醇(1∶99)、盐酸-50%甲醇(1∶99),盐酸-90%甲醇(1∶99),结果盐酸-90%甲醇(1∶99)超声后,样品溶液澄清,易过滤,滤液经乙酸乙酯萃取后测定,杂质峰少,提取率高,是从复方血竭凝胶中提取阿魏酸较理想的溶剂。本法操作简便、可靠,重复性好,专属性强,能有效控制该制剂的质量。
【参考文献】
[1] 闵凡新,李文玉,王彦为,等.HPLC法测定当归中阿魏酸的含量[J].中草药,2004,35(3)：332－333.
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【关键词】 复方血竭凝胶；阿魏酸；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To establish a method for determination of ferulic acid in Compound Xuejie Gels. Methods HPLC method was carried out on Zorbax SB-C18 (5 μm, 4.6 mm×250 mm), with detection wavelength at 320 nm. The mobile phase was composed of methanol-0.3% aqueous acetic acid (35∶65), the column temperature was 35 ℃ and the flow rate was 1.0 mL/min. Results The calibration curve was linear in the range of 0.031～0.310 μg (r＝0.999 9). The average recovery was 95.82% (RSD＝0.63%). Conclusion This method is simple, accurate, reliable and reproducible, and can be used for the quality control of the preparation.
Key words：Compound Xuejie Gels；Ferulic acid；HPLC；content determination
复方血竭凝胶由延胡索、血竭、乳香、当归、冰片5味中药组成,具有活血散瘀、消肿止痛、生肌止痒的功效。本试验选用阿魏酸作为指标成分,参考有关文献[1],建立了测定其含量的方法。通过方法学考察,本方法稳定性好,专属性强,可作为复方血竭凝胶的质量控制方法之一。
1 仪器与试药
Agilent 1100系列高效液相色谱仪(四元泵,美国)；超声波清洗器(HJ69-10L,北京中西远大科技有限公司)。阿魏酸对照品(批号0726-200208,中国药品生物制品检定所提供)；复方血竭凝胶(本院自制)。甲醇(分析纯,上海振兴化工一厂),其他试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)；流动相：甲醇-0.3%冰醋酸(35∶65)；检测波长：320 nm；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL/min。阿魏酸对照品溶液及供试品溶液均在11 min左右出现特征吸收峰,阴性对照在阿魏酸位置处无干扰。见图1。
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2.2.1 对照品溶液的制备
精密称取减压干燥48 h的阿魏酸对照品1.55 mg于50 mL量瓶中,加70%甲醇溶解定容,制成1 mL含阿魏酸31 μg的对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取复方血竭凝胶约2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入HCl-90%甲醇(1∶99)20 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用HCl-90%甲醇(1∶99)补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液5 mL,置分液漏斗中,用乙酸乙酯分次振摇提取4次(10、10、5、5 mL)。合并乙酸乙酯液,水浴蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5 mL棕色容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按处方比例和制备工艺制备不含当归的阴性样品,按供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液。
2.3 线性关系及检出限
精密量取“2.2.1”项下对照品储备液0.5、1、2、3、4、5 mL分别置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件依次进样20 μL,以进样量为横坐标,峰面积积分值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程：Y＝3 376.5X－4.078 5,r＝0.999 9,表明阿魏酸在0.031～0.310 μg范围内线性关系良好。同时将对照品溶液稀释后进样,检得最低检测限为5.95 μg/mL。
2.4 精密度试验
吸取阿魏酸对照品溶液10 μL,重复测定6次,RSD＝1.57%。
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2.5 稳定性试验
吸取同一供试品溶液10 μL,分别于0、1、2、4、6、8 h进样,测定峰面积,RSD＝1.90%。表明至少8 h内供试品溶液仍保持稳定。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品6份,按供试品溶液制备方法制备,测定,计算含量分别为0.082 0、0.079 1、0.081 9、0.079 2、0.081 1、0.079 9 mg/g,平均含量为0.080 5 mg/g,RSD＝1.71%。
2.7 加样回收率试验
精密称取已知含量的同批样品6份,分别加入阿魏酸对照品溶液(31 μg/mL)4、5、6 mL各2份,按供试品溶液制备方法制备后,HPLC测定,记录峰面积,计算回收率,结果见表1。表1 回收率试验结果（略）
2.8 样品含量测定
取样品3批,按照供试品溶液制备方法制备后,HPLC测定,结果见表2。表2 复方血竭凝胶3批样品含量测定结果(略)
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阿魏酸对光热不稳定,因此,在分析过程中样品宜放置于棕色容量瓶并避光保存,且不宜长时间高温加热。
在选择样品处理方法时,本试验对比了4种提取溶剂：甲醇、HCl-甲醇(1∶99)、盐酸-50%甲醇(1∶99),盐酸-90%甲醇(1∶99),结果盐酸-90%甲醇(1∶99)超声后,样品溶液澄清,易过滤,滤液经乙酸乙酯萃取后测定,杂质峰少,提取率高,是从复方血竭凝胶中提取阿魏酸较理想的溶剂。本法操作简便、可靠,重复性好,专属性强,能有效控制该制剂的质量。
【参考文献】
[1] 闵凡新,李文玉,王彦为,等.HPLC法测定当归中阿魏酸的含量[J].中草药,2004,35(3)：332－333.
