幽门螺杆菌ahpC基因的克隆与原核表达
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发布者：李艳青，段广才，宋春花，张建光，王淑玲，
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时间：2011年1月07日 10:27
【摘要】 目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)ahpC基因的原核表达系统，表达并纯化Ahp蛋白。方法 用PCR方法从中国分离株MEL-Hp27的染色体DNA中扩增出ahpC基因片段，将目的基因插入表达载体pET-30a中，构建重组质粒pET30a-ahpC。重组质粒经DNA测序鉴定后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达。采用镍离子亲和层析纯化蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。结果 PCR扩增的ahpC基因长度为594bp，经酶切和测序分析，插入到载体的基因与GenBank公布的序列相似性达99%；SDS-PAGE显示，经 IPTG诱导出分子质量为23ku的目的蛋白，且产量较高。结论 成功构建了ahpC表达载体pET30a-ahpC，并在大肠杆菌中高效表达。发表医学论文
【关键词】 幽门螺杆菌；ahpC基因；克隆；基因表达
ChinaABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression system of ahpC gene of Helicobacter pylori. Methods The ahpC gene was amplified from Hp chromosomal DNA by PCR technique and cloned into the expression vector pET-30a. The recombinant vector pET30a-ahpC was identified by DNA sequencing and transformed to E.coli BL21 (DE3) for expression under induction by IPTG. The expression product was analyzed by SDS-PAGE. Results PCR product showed that ahpC gene consisted of 594bp. The gene fragment that was inserted into the recombinant vector was identified to GenBank for 99%. SDS-PAGE showed that the induced protein was expressed highly in the host bacterium. Conclusion A prokaryotic high-expression system for ahpC gene has been successfully constructed. It can highly express r-AhpC protein in E.coli.
KEY WORDS: Helicobacter pylori; ahpC gene; cloning; gene expression发表医学论文
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的病原体，也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关 [1-4]。全世界范围内Hp的感染率超过50%[5]。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内还有多种抗氧化蛋白，其中烷基过氧化氢物还原酶(Ahp) 最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族 peroxiredoxins(prxs)的成员之一[6]。本研究利用基因克隆技术，将编码Hp ahpC外膜蛋白的基因经PCR扩增后，构建重组载体，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达和纯化，为进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
幽门螺杆菌中国分离株MEL-Hp27(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-T Vector、Protein marker、T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。
发表医学论文
1.2 方法
1.2.1 Hp基因组DNA的提取
刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取Hp DNA。
1.2.2 AhpC编码基因的扩增
根据GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′ -CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下划线为NdeⅠ酶切位点；P2的序列为：5′ -CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点。
以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性 30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
1.2.3 重组载体的构建
回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pMD18-T载体1μL、 PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经蓝白斑筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以 10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22℃进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET30a-ahpC再经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 重组质粒的转化
将重组载体pET30a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养 12～16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。抽提质粒，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任公司完成。
1.2.5 重组载体在E.coli中的表达
取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至A600达到0.5时，加入终浓度为 0.3mmol/L的IPTG诱导，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照，采用SDS-PAGE电泳分析重组AhpC的表达。优化诱导表达条件,用 UVP凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。1.2.6 表达纯化rAhpC蛋白
将大量诱导的细菌4℃ 4000g离心收集细菌，PBS洗菌1次，重悬于纯水中，-20℃过夜后超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化效果。发表医学论文
2 结 果
2.1 Hp ahpC编码基因的扩增
以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，在600bp附近有单一条带，片段的大小与预计相符(图1)。
2.2 重组载体的酶切鉴定
回收幽门螺杆菌ahpC基因的PCR产物，与pMD18-T连接后转化感受态DH5α受体菌，经蓝白斑筛选试验挑取白色菌斑扩增培养后，提取 pMD18T-ahpC质粒。经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切切出约600bp片段，回收后与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pET-30a 连接，获得阳性重组质粒，命名为pET30a-ahpC。重组质粒双酶切鉴定得到1条约594bp的带，与实验设计相一致(图2)，第3泳道出现第3条带，可能是因为双酶切时间为10h，酶切时间过长产生的非特异条带，但对实验结果无影响。
2.3 ahpC基因序列的分析
ahpC基因的测序结果见图3。ahpC的碱基测序结果与GenBank已公布的Hp菌株编码ahpC基因的序列进行同源性比对,其一致性达99%(590/594),其编码的氨基酸序列同源性为99%(197/198)。发表医学论文
2.4 重组载体在E.coli中的表达及表达形式鉴定
重组质粒pET30a-ahpC转化至E.coli BL21(DE3)中获得重组工程菌，接种LB液体培养基，于37℃培养至A600达到0.5时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导4h，收集菌体进行SDS-PAGE检测。可见在Mr 23ku处出现1条新的蛋白带，与理论预测值相符(图4)。
2.5 重组表达蛋白rAhpC的纯化
可溶性分析目的蛋白主要以可溶性方式存在。选取镍离子亲和层析柱纯化蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测洗脱液目的蛋白的分子大小。经UVP凝胶成像系统分析，洗脱所得目的蛋白的分子质量为23ku(图5)。
3 讨 论
大多数细胞都具有产生和清除活性氧(ROS)的能力。在正常情况下，活性氧是作为分子氧单电子还原反应的不可避免的产物。正常细胞具有相关的保护机制维持细胞内最低水平的活性氧浓度。而过氧化氢是一种稳定的活性氧分子，能够穿过细胞膜并且在多种细胞的生理过程中起着重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表达、转录因子的活化、DNA合成和细胞分裂等过程。高浓度过氧化氢对细胞具有毒性，尤其是能够对细胞组分造成损伤；而适当浓度的过氧化氢可以作为第2信使分子参与信号传导途径并调节细胞代谢。而黄单胞菌中，Ahp和CAT(过氧化氢酶)等共同调控细胞内过氧化氢的水平，ahpC突变能引起细胞内过氧化氢水平下降[7]。黄志刚等[5]利用同源重组技术构建了Hp27基因敲除突变株 (Hp27△cagA)，并利用蛋白质组学技术进行差异蛋白质的研究，发现Ahp在cagA基因敲除突变株菌体蛋白中表达下降，可能影响Hp的抗氧化应急能力。本研究对编码Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因进行克隆，并进行序列测定，所得序列与GenBank公布的序列一致性为99%；成功构建重组表达载体pET30a-ahpC，经过双酶切及测序鉴定，结果与预测一致；经42℃转化入感受态细胞BL21中；重组工程菌在37℃使用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约为23000的目的蛋白；经超声破菌和电泳分析，重组表达蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。经镍离子亲和柱层析纯化得到烷基过氧化氢还原酶的重组蛋白。本研究为进一步研究烷基过氧化氢还原酶的作用机制奠定了基础。发表医学论文
【参考文献】
1]HUSSELL T, ISAACSON PG, CRABTREE JE, et al. The response of cells from low-grade B-cell gastric lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue to Helicobacter pylori [J]. Lancet, 1993, 342(8871):571-574.
[2]DE ROSTER E, BUSET M, FERNANDES E, et al. Helicobacter pylori: the link with gastric cancer [J]. Eur J Cancer Prev, 1994, 3(3):247-257.
[3]YAN J, HU AP, LI Q. Establishment of Helicobacter pylori infection model in Mongolian gerbil [J]. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):21-23.
[4]CHEN XJ, YAN J, MAO YF. Analysis on the vacA dominant genotypes and their nucleotide sequences of Helicobacter pylori isolates in Zhejiang area [J]. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):24-28.
[5]黄志刚，段广才. 幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)致病的分子机制研究 [D]. 郑州大学, 2007.
[6]PAPINUTTO E, WINDLE H J, CENDRON L, et al. Crystal structure of alkyl hydroperoxide-reductase (AhpC) from Helicobacter pylori [J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1753(2):240-246.
[7]李欣，李红玉. 植物病原细菌中内源过氧化氢的产生、功能及其在与植物互作中的作用 [D]. 兰州大学, 2007.
【关键词】 幽门螺杆菌；ahpC基因；克隆；基因表达
ChinaABSTRACT: Objective To construct a prokaryotic expression system of ahpC gene of Helicobacter pylori. Methods The ahpC gene was amplified from Hp chromosomal DNA by PCR technique and cloned into the expression vector pET-30a. The recombinant vector pET30a-ahpC was identified by DNA sequencing and transformed to E.coli BL21 (DE3) for expression under induction by IPTG. The expression product was analyzed by SDS-PAGE. Results PCR product showed that ahpC gene consisted of 594bp. The gene fragment that was inserted into the recombinant vector was identified to GenBank for 99%. SDS-PAGE showed that the induced protein was expressed highly in the host bacterium. Conclusion A prokaryotic high-expression system for ahpC gene has been successfully constructed. It can highly express r-AhpC protein in E.coli.
KEY WORDS: Helicobacter pylori; ahpC gene; cloning; gene expression发表医学论文
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是一种定植于人类胃黏膜的革兰染色阴性、螺旋状、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性溃疡的病原体，也与胃腺癌及黏膜相关性淋巴瘤的发生密切相关 [1-4]。全世界范围内Hp的感染率超过50%[5]。Hp是一种对氧敏感的微需氧菌，菌体内还有多种抗氧化蛋白，其中烷基过氧化氢物还原酶(Ahp) 最为丰富，其作用是通过在高氧化环境中还原有毒的氢化氧化物来实现的。Ahp由ahpC基因编码，是抗氧化酶家族 peroxiredoxins(prxs)的成员之一[6]。本研究利用基因克隆技术，将编码Hp ahpC外膜蛋白的基因经PCR扩增后，构建重组载体，并在E.coli BL21(DE3)中进行表达和纯化，为进一步研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
幽门螺杆菌中国分离株MEL-Hp27(简称Hp27)及质粒pET-30a由本实验室培养和保存；镍柱、大肠杆菌DH5α、BL21 (DE3)购自创生公司；限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、pMD18-T Vector、Protein marker、T4 DNA连接酶均购自大连TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker、细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA电泳胶回收、质粒抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。引物合成由北京赛百盛生物工程公司完成，DNA测序由北京三博远志生物有限责任公司完成。其他试剂均为国产分析纯。
发表医学论文
1.2 方法
1.2.1 Hp基因组DNA的提取
刮取经3d培养的Hp培养板上的Hp，以12000r/min离心1min，取沉淀按细菌基因组抽提试剂盒操作方法提取Hp DNA。
1.2.2 AhpC编码基因的扩增
根据GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列为：5′ -CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3′，下划线为NdeⅠ酶切位点；P2的序列为：5′ -CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT-3′，下划线为XhoⅠ酶切位点。
以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性 30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，共循环35次，最后于72℃延伸5min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，观察扩增结果并用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
1.2.3 重组载体的构建
回收的PCR产物与pMD18-T按照载体与插入DNA的摩尔比为1∶6的比例混合后，置16℃连接过夜，体系为pMD18-T载体1μL、 PCR产物2μL、双蒸水2μL、连接液5μL。经蓝白斑筛选鉴定的pMD18T-ahpC和表达载体pET-30a用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以 10g/L琼脂糖凝胶电泳并进行胶回收后，用T4DNA连接酶于22℃进行连接，pET-30a片段与插入DNA的摩尔比为1∶(1～3)。连接后的重组表达载体pET30a-ahpC再经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.4 重组质粒的转化
将重组载体pET30a-ahpC转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，构建的重组工程菌涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基，37℃培养 12～16h，挑选单菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，置37℃摇床振荡培养12h。抽提质粒，以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA碱基序列测定由北京三博志远生物有限责任公司完成。
1.2.5 重组载体在E.coli中的表达
取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养至A600达到0.5时，加入终浓度为 0.3mmol/L的IPTG诱导，于诱导过程中取样，同时作空载体菌对照，采用SDS-PAGE电泳分析重组AhpC的表达。优化诱导表达条件,用 UVP凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。1.2.6 表达纯化rAhpC蛋白
将大量诱导的细菌4℃ 4000g离心收集细菌，PBS洗菌1次，重悬于纯水中，-20℃过夜后超声破碎，12000g离心，收集上清及沉淀。使用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，SDS-PAGE电泳检查蛋白纯化效果。发表医学论文
2 结 果
2.1 Hp ahpC编码基因的扩增
以Hp中国分离株MEL-Hp27基因组DNA为模板进行PCR扩增，所获PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，在600bp附近有单一条带，片段的大小与预计相符(图1)。
2.2 重组载体的酶切鉴定
回收幽门螺杆菌ahpC基因的PCR产物，与pMD18-T连接后转化感受态DH5α受体菌，经蓝白斑筛选试验挑取白色菌斑扩增培养后，提取 pMD18T-ahpC质粒。经限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切切出约600bp片段，回收后与用同样限制性内切酶双酶切的表达载体pET-30a 连接，获得阳性重组质粒，命名为pET30a-ahpC。重组质粒双酶切鉴定得到1条约594bp的带，与实验设计相一致(图2)，第3泳道出现第3条带，可能是因为双酶切时间为10h，酶切时间过长产生的非特异条带，但对实验结果无影响。
2.3 ahpC基因序列的分析
ahpC基因的测序结果见图3。ahpC的碱基测序结果与GenBank已公布的Hp菌株编码ahpC基因的序列进行同源性比对,其一致性达99%(590/594),其编码的氨基酸序列同源性为99%(197/198)。发表医学论文
2.4 重组载体在E.coli中的表达及表达形式鉴定
重组质粒pET30a-ahpC转化至E.coli BL21(DE3)中获得重组工程菌，接种LB液体培养基，于37℃培养至A600达到0.5时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导4h，收集菌体进行SDS-PAGE检测。可见在Mr 23ku处出现1条新的蛋白带，与理论预测值相符(图4)。
2.5 重组表达蛋白rAhpC的纯化
可溶性分析目的蛋白主要以可溶性方式存在。选取镍离子亲和层析柱纯化蛋白，收集洗脱液，SDS-PAGE电泳检测洗脱液目的蛋白的分子大小。经UVP凝胶成像系统分析，洗脱所得目的蛋白的分子质量为23ku(图5)。
3 讨 论
大多数细胞都具有产生和清除活性氧(ROS)的能力。在正常情况下，活性氧是作为分子氧单电子还原反应的不可避免的产物。正常细胞具有相关的保护机制维持细胞内最低水平的活性氧浓度。而过氧化氢是一种稳定的活性氧分子，能够穿过细胞膜并且在多种细胞的生理过程中起着重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表达、转录因子的活化、DNA合成和细胞分裂等过程。高浓度过氧化氢对细胞具有毒性，尤其是能够对细胞组分造成损伤；而适当浓度的过氧化氢可以作为第2信使分子参与信号传导途径并调节细胞代谢。而黄单胞菌中，Ahp和CAT(过氧化氢酶)等共同调控细胞内过氧化氢的水平，ahpC突变能引起细胞内过氧化氢水平下降[7]。黄志刚等[5]利用同源重组技术构建了Hp27基因敲除突变株 (Hp27△cagA)，并利用蛋白质组学技术进行差异蛋白质的研究，发现Ahp在cagA基因敲除突变株菌体蛋白中表达下降，可能影响Hp的抗氧化应急能力。本研究对编码Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因进行克隆，并进行序列测定，所得序列与GenBank公布的序列一致性为99%；成功构建重组表达载体pET30a-ahpC，经过双酶切及测序鉴定，结果与预测一致；经42℃转化入感受态细胞BL21中；重组工程菌在37℃使用IPTG进行诱导表达，SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约为23000的目的蛋白；经超声破菌和电泳分析，重组表达蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。经镍离子亲和柱层析纯化得到烷基过氧化氢还原酶的重组蛋白。本研究为进一步研究烷基过氧化氢还原酶的作用机制奠定了基础。发表医学论文
【参考文献】
1]HUSSELL T, ISAACSON PG, CRABTREE JE, et al. The response of cells from low-grade B-cell gastric lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue to Helicobacter pylori [J]. Lancet, 1993, 342(8871):571-574.
[2]DE ROSTER E, BUSET M, FERNANDES E, et al. Helicobacter pylori: the link with gastric cancer [J]. Eur J Cancer Prev, 1994, 3(3):247-257.
[3]YAN J, HU AP, LI Q. Establishment of Helicobacter pylori infection model in Mongolian gerbil [J]. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):21-23.
[4]CHEN XJ, YAN J, MAO YF. Analysis on the vacA dominant genotypes and their nucleotide sequences of Helicobacter pylori isolates in Zhejiang area [J]. Zhejiang Daxue Xuebao: Yixueban, 2003, 32(1):24-28.
[5]黄志刚，段广才. 幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)致病的分子机制研究 [D]. 郑州大学, 2007.
[6]PAPINUTTO E, WINDLE H J, CENDRON L, et al. Crystal structure of alkyl hydroperoxide-reductase (AhpC) from Helicobacter pylori [J]. Biochim Biophys Acta, 2005, 1753(2):240-246.
[7]李欣，李红玉. 植物病原细菌中内源过氧化氢的产生、功能及其在与植物互作中的作用 [D]. 兰州大学, 2007.
