小百部药材的总皂苷含量与质量标准研究

【摘要】  　　目的建立小百部药材的总皂苷含量测定方法并制订质量标准，为该药材的质量控制提供科学依据。方法以小百部苷B为对照品，浓硫酸∶甲醇（7∶3）为显色剂建立比色法测定小百部的总皂苷含量；采用《中国药典》2005版规定的水分测定法、灰分测定法测定小百部药材的水分、总灰分和酸不溶性灰分。结果小百部苷B在10.6～127.2 μg范围内呈良好的线性关系，r = 0.999 7，平均加样回收率为98.36%，RSD=2.38% (n=6)；小百部总皂苷含量为5.96%～7.98%。结论该法操作简便、准确，可用作小百部药材质量评价的定量分析方法。根据测定结果，建议小百部药材总皂苷含量以干燥品计不低于6.0%。

【关键词】  小百部　质量标准　小百部苷B　比色法

　　Abstract：ObjectiveTo establish a colorimetric method to determine the total saponins of Asparagus filicinus root for quality evaluation. MethodsA colorimetric method was established with aspafilioside B as the chemical reference and a mixture of sulfuric acid and methanol (7:3) as the coloring reagent. The moisture, total ash and acid-insoluble ash were determined according to the methods in Chinese Pharmacopoeia 2005.ResultsThere was a good linearity ( r = 0. 9997) within the range of 10.6～127.2 μg. The average recovery of aspafilioside B was 98.36% with RSD of 2.38%. The contents of total saponins were 5.96% ～7.98%. ConclusionThe newly-developed colorimetric method can be used for the quality control of Asparagus filicinus root. It is proposed to contain not less than 6.0% of saponins calculated with reference to the dried drug.

　　Key words： Asparagus filicinus;   Quality standard;   Aspafilioside B;   Colorimetry
    
　　小百部又名滇百部，为百合科(Liliaceae) 天门冬属(Asparagus) 植物羊齿天门冬Asparagus filicinus Buch.-Ham. ex D.Don的块根，主产于云南和四川，为云南彝族和傣族的习用药物，用于治疗气管炎、肺炎和咳嗽，在云南省的一些地区，也作为中药百部的代用品［1］。2005版《云南省中药饮片标准》收录了“滇百部饮片”和“蜜滇百部”，但均未见定量测定［2］。现代药理学研究表明，小百部具有较强的抗肿瘤活性，超过了同属抗癌药用植物芦笋，是一种具有良好开发前景的天然药物［3］。本课题组前期的化学和药理实验表明，小百部的小百部苷甲、小百部苷B等6个皂苷类化合物对人肺腺癌A-549和乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制活性，皂苷类化合物是小百部抗肿瘤作用的主要活性成分［4］。为了更好地开发利用小百部药材，本文建立比色法对10个不同产地和不同收集时间的小百部药材进行了总皂苷含量的测定，同时测定了水分、总灰分和酸不溶性灰分，以期为制订小百部的质量标准提供依据和参考。

　　1 仪器与试药

    756MC紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）；SHANGPING FA1004天平（上海天平仪器厂）；DHG系列电热恒温鼓风干燥箱（上海华连医疗器械有限公司）；马弗炉（上海鼎奇实业有限公司）；甲醇、浓硫酸等试剂均为分析纯。对照品小百部苷B由本课题组自制［4］，经HPLC-ELSD检测，纯度达98%以上；经鉴定，10个小百部药材均为A. filicinus的干燥根，凭证样本保存于本教研室。

　　2  方法与结果

　　2.1  总皂苷含量测定

　　2.1.1  对照品溶液制备精密称定小百部苷B对照品适量，以甲醇溶解，制成1.06 mg/ml的溶液。

　　2.1.2   供试品溶液制备精密称取小百部药材粉末0.5 g，用20 ml甲醇超声提取30 min，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 ml，蒸去溶剂，精密加入5 ml水，使溶解，过滤，精密吸取续滤液1 ml，加于已处理好的ADS-7大孔树脂柱（玻璃柱，1×30 cm，湿法装柱，树脂床体积为5 ml，用20 ml水预洗，控制流速为15～20滴/ min），先用20 ml水洗至还原糖反应呈阴性，弃去水洗液，再用20 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，50 ℃减压蒸干，用甲醇溶解并定容至2 ml，摇匀，作为供试品溶液。

　　2.1.3  显色方法及测定波长的选择取对照品溶液和供试品溶液各0.5 ml，挥干溶剂，加入新配制的浓硫酸-甲醇(7∶3) 5 ml，60 ℃水浴中加热60 min，取出，立即置冰水浴中冷却5 min，摇匀，冰水浴中静置10 min，以浓硫酸-甲醇(7∶3)为空白对照，在200～400 nm扫描，结果显示对照品溶液和供试品溶液均在320 nm附近有最大吸收，空白无干扰。因而选定320 nm作为测定波长。

　　2.1.4 标准曲线的制备 

　　精密吸取对照品溶液10，20，40，60，80，100，120 μl，按“2.1.3”项下方法显色，分别在320 nm处测定吸光度，并做空白对照。以吸光度为纵坐标，对照品质量(μg)为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程为Y= 0.007 9X- 0.125 4，r = 0.999 7，线性范围为10.6～127.2 μg。

　　2.1.5  稳定性实验取同一供试品溶液，按“2.1.3”项下方法显色，于320 nm每隔20 min测定吸光度，测完立刻放回冰水浴中。结果表明，供试品溶液在冰水浴中2 h内稳定。

　　2.1.6  精密度实验精密吸取对照品液40 μl，按“2.1.3”项下方法显色，320 nm处重复测定吸光度值6次，求得 RSD值为2.32%（n=6）。

　　2.1.7  重复性实验取同批小百部药材粉末6份，分别按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，按照“2.1.3”项下方法显色，320 nm处测定吸光度值，计算含量，求得RSD值为2.72%（n=6）。

　　2.1.8  加样回收率测定取“2.1.7”项下所用小百部药材粉末约0.25 g，共6份，用20 ml甲醇超声提取30 min，用甲醇补足失重，摇匀，过滤，精密吸取续滤液5 ml，蒸去溶剂，精密加入5 ml水，过滤，精密吸取续滤液1 ml。另取对照品溶液700 μl，挥干溶剂后加入前述1ml续滤液，溶解后加入已处理好的大孔树脂柱纯化浓缩，按照“2.1.3”项下方法显色，320 nm处测定吸光度值，计算得平均加样回收率为98.36%，RSD 2.38%（n=6）。

　　2.1.9  含量测定 

　　取不同产地的10批小百部药材粉末0.5 g，精密称定，按“2.1.7”项下方法分别提取测定，计算含量。结果见表1。

2.2  水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定

　　2.2.1  测定方法 

　　水分测定参照《中国药典》2005年版（Ⅰ部）附录ⅨH水分测定法（烘干法）；总灰分、酸不溶性灰分测定参照《中国药典》2005年版（Ⅰ部）附录ⅨK灰分测定法 ［5］。

　　2.2.2  测定结果10批样品的水分、总灰分和酸不溶性灰分测定结果见表1。表1  小百部药材的总皂苷含量及各检查项测定结果（略）

　　3  讨论

    本文所研究的小百部又名滇百部［1］。本品首次以“小百部”药材名收载于《云南省药品标准》1974版，明确来源为“百合科植物羊齿天门冬Asparagus filicinus Ham.的去皮干燥块根” ［6］；在2005版《云南省中药饮片标准》中则以“滇百部饮片”和“蜜滇百部”收录［2］。“小百部”一名亦见于2005版《中国药典》附录，但其来源被定为“百合科植物小天门冬A. pseudofilicinus Wang et Tang的干燥根”［5］。经查，《中国药典》附录收载的“小百部”为成方制剂“雅叫哈顿散”的配伍药材之一，傣药“雅叫哈顿”最早也收载于1974年版《云南省药品标准》，但当时处方中明确列出的是“小天冬”，而不是“小百部”，且明确记载百合科小天冬A. pseudofilicinus Wang et Tang与天门冬A. cochinchinensis（Lour.）Merr.的干燥块根同为药材天门冬的正品来源，与同时收录的小百部（羊齿天门冬A. filicinus Ham.的去皮干燥块根）实为两个不同的药材品种［6］。此外，徐国钧等［7］学者核查后也指出小百部的学名应采用A. filicinus Ham. ex D. Don。综合以上分析，我们认为2005版《中国药典》“雅叫哈顿散”处方及附录中收录的“小百部”一名有误，应更正为“小天冬”。
    实际上，小百部药材的名称和基源一直比较混乱。在第2版《中药大辞典》中收录的“小百部”来源为百合科天门冬属植物石刁柏A. officinalis L.的块根，而本文研究的小百部（滇百部）则以其原植物名“羊齿天冬”收录其中［8］。同样以“羊齿天冬”收录的还有《全国中草药汇编》 ［9］、《现代中药学大辞典》［10］等。综合实际情况和各文献考虑，我们建议来源于羊齿天门冬块根的药材统一采用“小百部（滇百部）”之名，以示区分。

    本课题组前期对小百部化学成分的研究分离得到12个甾体皂苷，体外抗肿瘤活性测试发现，其中的小百部苷甲、小百部苷B等6个化合物对人肺腺癌A-549和乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制活性，表明皂苷类化合物是小百部抗肿瘤作用的主要活性成分［4］。另外，本课题组曾建立HPLC-ELSD法测定小百部中小百部苷B的含量，结果显示，不同产地的小百部药材中小百部苷B的含量从0.128%至0.361%不等，含量差异较大；同时发现天门冬药材的HPLC图谱中无小百部苷B峰，选择小百部苷B作为评价小百部药材质量的指标性成分具有一定的专属性［11］。因此，本实验选择抗肿瘤活性较好的小百部苷B为对照品，建立比色法测定小百部药材的总皂苷含量，作为评价小百部药材质量的参考依据。

    对供试品溶液的制备方法，我们分别考察了提取溶剂（甲醇、50%乙醇）、提取溶剂用量（10，20，30 ml）、提取方式（超声，加热回流、渗漉）、提取时间（20，30，40 min），最后确定甲醇20 ml超声30 min可提取完全且操作简便易行。同时对纯化方式也进行了考察，主要比较了正丁醇萃取和大孔树脂纯化法，测得的总皂苷含量分别为4.96%和6.02%（云南曲靖2003-09收集样品），另外正丁醇萃取法存在操作繁琐、气味难闻等缺点，而大孔吸附树脂具有吸附容量大、选择性好、易解吸、效率高等优点［12］，且加样回收率实验结果满意，故采用大孔树脂作为纯化方式。

    含量测定结果表明，不同产地的小百部药材的总皂苷含量为5.96%～7.98%，与HPLC-ELSD法测定小百部中小百部苷B的含量结果 ［11］相比，总皂苷含量相对稳定，且考虑到小百部的多个皂苷类成分均具有抗肿瘤活性，因此，以总皂苷含量来控制小百部药材的质量更为合理。根据本实验的测定结果，我们建议小百部药材的总皂苷含量以小百部苷B计不少于5.0%；如果以干燥品计，总皂苷含量不少于6.0%。

    水分、总灰分和酸不溶性灰分的测定结果显示，小百部药材的水分含量为6.29%～9.50%，水分较高，总皂苷含量应以干燥品计算较为合理；总灰分含量3.22%～4.38%，各批次间差异不显著；酸不溶性灰分含量较低，从0.110%～0.510%不等。依据上述结果，建议水分不超过10.0%，总灰分不超过5.0%，酸不溶性灰分不得超过1.0%。此研究结果可作为制定小百部药材质量标准的参考依据。

【参考文献】
  　　［1］云南省药材公司．云南中药资源名录［M］．北京：科学出版社，1993：630．

　　［2］云南省食品药品监督管理局．云南省中药饮片标准［S］．昆明：云南美术出版社，2005：86．

　　［3］温晶源，李颖，丁声颂．中国百合科天门冬属九种药用植物的药理作用筛选［J］．上海医科大学学报，1993，20（2）：107．

　　［4］Zhou L B，Chen T H，Bastow K F，et al．Filiasparosides A-D,Cytotoxic Steroidal Saponins from the Roots of Asparagus filicinus［J］．J．Nat．Prod，2007，70（8）：1263．

　　［5］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2005：附录47．

　　［6］云南省卫生局．云南省药品标准［S］．北京：科学出版社，1974：58 ，62，322．

　　［7］徐国钧，徐珞珊．常用中药材品种整理和质量研究［M］．福州：福建科学技术出版社，1997：64．

　　［8］南京中医药大学．中药大辞典，第2版［M］．上海：上海科学技术出版社，2006：337．

　　［9］谢宗万．全国中草药汇编，第2版［M］．北京：人民出版社，1996：322．

　　［10］宋立人, 洪 恂, 丁绪亮, 等．现代中药学大辞典［M］．北京：人民卫生出版社，2001：904．

　　［11］白 桦，冯 举，陈道峰．HPLC-ELSD法测定小百部中小百部苷B的含量［J］．复旦学报（医学版），2004，31（5）：521．

　　［12］潘俊杰，郑 琴，杨 明．三七中三七总皂苷的提取、分离纯化及分析方法的研究进展［J］．世界科学技术-中药现代化，2007，9（6）：77．