蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响

【摘要】  　　目的探讨蝎毒多肽提取物（PESV）对E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响，探究PESV对白血病细胞髓外浸润的影响与机制。方法NOD-SCID小鼠50只，建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型，随机分为5组，每组10只，分别为PESV高、中、低剂量组，模型组和空白组。PESV高、中、低剂量组小鼠分别尾静脉注射PESV 1.2，0.6，0.3 mg/kg,模型组和空白组均注射0.9%的生理盐水0.3 ml，治疗28 d后，用流式细胞术检测小鼠外周血中CD49d和CXCR4的表达，35 d处死小鼠后用免疫组化法检测其肝脏中E-钙黏蛋白表达。结果治疗组CD49d和CXCR4的表达均低于模型组（P＜0.01），各治疗组E-钙黏蛋白表达均高于模型组（P＜0.01）。结论PESV可以有效地提高白血病小鼠E-钙黏蛋白的表达，降低CD49d和CXCR4的表达，具有较好的阻抑白血病细胞髓外浸润的作用。

【关键词】  蝎毒多肽提取物　白血病　 E-钙黏蛋白　CD49d　 CXCR4

    恶性肿瘤的浸润过程包括：组织浸润、淋巴管渗透、血管渗透、浆膜及黏膜蔓延等，其转移过程与黏附因子密切相关。而白血病的浸润为白血病细胞首先从骨髓中逸出到外周血液，而后受到趋化作用进而黏附到血管内皮上并产生迁移、降解细胞外基质，继而在髓外组织生存、增殖最后形成浸润灶， 以上过程受到多种因子调控，其中黏附因子的关系最为密切［1，2］。本实验旨在运用流式细胞术和免疫组化研究PESV对白血病小鼠黏附因子CD49d、CXCR4和E-钙黏蛋白表达的影响，探讨PESV阻止细胞黏附的效应靶点,为将其运用于临床防治白血病髓外浸润提供可靠的理论依据。

　　1  材料与仪器

　　1.1  小鼠及分组SPF级的健康NOD-SCID雌鼠50只，3～4周龄，体质量18～20 g，购于中国医学科学院实验动物研究所，随机分为5组，每组10只，即空白对照组，模型组，PESV高剂量组，PESV中剂量组，PESV低剂量组。各组实验前均在137cs源环境下照射270 cGy，除空白对照组外，其余各组均在照射后24 h静脉或腹腔注射浓度2×107个人的骨髓单个核细胞［3］。注射单个核细胞后第2天，腹腔注射G-CSF 0.3 ml/只，连续7 d。停用G-CSF后，蝎毒多肽高剂量组、蝎毒多肽中剂量组、蝎毒多肽低剂量组分别腹腔注射高（1.2 mg/kg）、中（0.6 mg/kg）、低（0.3 mg/kg）剂量的蝎毒多肽提取物，空白组给予等量的0.9%生理盐水，在SPF条件下饲养28    d后开始进行相关指标检测。28 d后高、中、低剂量治疗组小鼠分别存活9只，7只，7只，模型组存活6只，空白对照组存活10只。

　　1.2  药物取蝎毒冻干粉溶解(1 g/40 ml, pH 7. 4)，低温离心，5 000 r/min，30 min；0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤，将超滤物冻干。取蝎毒冻干粉400 mg加磷酸缓冲液上样，经葡萄糖凝胶，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰，再进行阳离子交换层析，对该部位用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪进行检测，收集PESV蛋白峰，临用时PESV用生理盐水溶解稀释成各浓度。

　　1.3  试剂和仪器

　　1.3.1  流式检测荧光素标记羊抗小鼠IgG/FITC（由北京博奥森生物技术有限公司提供），未标记的抗小鼠的CXCR4抗体（由eBioscience公司提供），FITC标记的抗小鼠CD49b抗体，A液（甲酸
　　1.2 ml/l,天津中医药大学中心实验室提供），流式细胞仪(FACS420型)为美国BD公司产品。

　　1.3.2  免疫组化显微镜（麦克奥迪 BA400 ），成像系统（Motic Images Advanced 3.2），恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司 SKP-02.600），微波炉（格兰仕 WD800S），二甲苯，无水乙醇（北京化工厂产品），第一抗体（武汉博士德 BA0475 E-Cadherin），生物素标记的第二抗体（生物素标记山羊抗兔IgG，北京鼎国），辣根过氧化酶标记链亲和素溶液（1∶1 000倍稀释，北京鼎国，HD009-1），DAB工作液（北京鼎国，DDAB-002），过氧化物酶阻断剂（北京鼎国），苏木素复染液（北京鼎国）。

　　2  方法

　　2.1  外周血中CD49d表达的检测取100 μl外周血加入流式管底部，加入0.5 μl FITC标记的CD49b抗体，涡旋使其与外周血混匀，避光孵育30 min，加A液，用流式细胞仪检测。

　　2.2  外周血中CXCR4表达的检测取40 μl外周血加入流式管底部，加入1 μl（1 mg/ml）的未标记的抗小鼠的CXCR4抗体，涡旋使其与外周血混匀，避光孵育30 min，用2 ml的PBS重悬细胞，800 r·min-1离心5 min，洗涤两次，洗去未结合的一抗，加FITC标记的二抗0.1 μl，避光孵育30 min，800 r·min-1离心5 min，去上清，PBS洗涤两次，加入A液，再加500 ml PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。

　　2.3  免疫组化小鼠处死后取肝脏，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，65℃烤片4 h。二甲苯脱蜡。梯度酒精水化后，在蒸馏水中浸泡5 min。0.01 mol/L PBS（pH=7.4）浸泡5 min/次，3次。加50 μl 过氧化酶阻断剂，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。0.01  mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。0.01 mol/L柠檬酸盐抗原修复液，微波炉最低档抗原修复20 min。加50 μl 正常羊非免疫血清，室温下孵育30 min。加50 μl一抗，37℃孵育60 min。0.01 mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。加50 μl二抗，37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS浸泡5 min/次，3次。加50 μl辣根过氧化酶标记链亲和素溶液，37℃孵育30 min。0.01 mol/L PBS 浸泡5 min/次，3次。加100 μl新鲜配制的DAB工作液，显微镜下观察5～30 min。苏木素复染，脱水、中性树胶封固。

　　2.4  免疫组化诊断标准阳性定位 ,E-钙黏蛋白表达主要定位于细胞浆上，细胞浆出现清晰棕黄色为阳性。每张切片分别观察10个高倍镜视野，每个高倍视野计数100个细胞数，计算出每张切片的阳性细胞百分数。

　　2.5  统计学分析数据用±s表示，多组间比较，用t检验。全部数据用SPSS13.0统计软件协助处理。

　3  结果

　　3.1  各组CD49d表达水平的比较见表1。表1  各组CD49d表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较，有显著性差异（P＜0.01）。PESV低剂量组和高中剂量比较有显著性差异（P＜0.01），中高剂量之间没有差异（P＞0.01）。空白组与各治疗组相比，与PESV低剂量组有显著统计学差异（P＜0.01），与中剂量组有统计学差异（P＜0.05），与高剂量组无统计学差异（P＞0.01）。见图1～4。        

　　3.2  各组CXCR-4表达水平的比较见表2。表2  各组CXCR-4表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较，其中PESV低剂量组与模型组没有差异（P＞0.01），中高剂量组与模型组比较有差异（P＜0.05）。各治疗组与空白组比较，其中低中剂量组与空白组有显著差异（P＜0.01），高剂量组与空白组没有显著差异（P＞0.01）。见图5～8。   

　　3.3  各组E-钙黏蛋白表达水平的比较见表3。表3  各组E-钙黏蛋白表达水平的比较（略）

    各治疗组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01），PESV低中剂量组比较有统计学意义（P＜0.05），高剂量与低中剂量比较有显著性差异（P＜0.01），高剂量与空白组比较有统计学意义（P＜0.05）。见图9～12。

　　4  讨论

    急性白血病的髓外浸润和转移是影响临床化疗和预后的重要原因，因此预防和治疗白血病髓外浸润成为了提高白血病临床疗效，延长患者生存时间，以及改善患者生存质量，防止复发的关键。目前关于中药预防白血病复发、髓外浸润的研究逐渐增多，如砷制剂、雄黄、蝎毒等。贾莉等［4～6］通过实验证明蝎毒可明显地抑制人B淋巴细胞株Raji、人早幼粒白血病细胞株HL-60、人红白血病细胞株K562细胞的生长并诱导其凋亡，本课题的前期研究证实全蝎具有诱导人白血病HL-60程序性死亡的作用［7,8］。本实验研究发现PESV对白血病小鼠的黏附因子CD49d、CXCR4和E-钙黏蛋白表达有明显的调节作用。

    黏附分子是一大类以配体-受体对应形式发挥作用的糖蛋白或糖脂，广泛分布于细胞表面或细胞外基质中，介导细胞—细胞、细胞—基质或细胞—基质—细胞之间的黏附参与细胞的信号转导与活化、移动、生长及分化，以及炎症、肿瘤、创伤愈合等一系列生理及病理过程。而CD49d属黏附分子整合素家族中的非常晚期抗原(very late antigen，VL～)，是胶原、层黏连蛋白和纤维连接蛋白等的配体，主要介导细胞与细胞基质的黏附和白细胞与血管内皮细胞的黏附。浸润征象越明显，CD49d阳性率越高。提示CD49d的大量表达，赋予白血病细胞极强的侵袭能力，促使白血病细胞透过血管内皮细胞，导致组织器官浸润和病灶转移。本实验显示各治疗组与模型组比较，有显著性差异（P＜0.01），这表明各治疗量对白血病小鼠的CD49d表达均有影响，并且低剂量组和高中剂量组比较有显著性差异（P＜0.01），提示高中剂量治疗效果明显优于低剂量。PESV通过减少CD49d阳性率，降低白血病细胞与血管内皮细胞的黏附力，阻碍白血病细胞在靶器官立足，从而减少了白血病细胞对髓外组织的浸润和侵袭。

    CXCR4是趋化因子亚家族CXC成员之一，其配体是基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)，是主要由骨髓基质细胞产生的趋化因子，二者特异结合，不仅是炎症时淋巴、单核细胞向炎症部位趋化的动力，也是非炎症时影响细胞体内迁移的重要因素［9］。Voermans等［10］在体外实验表明,白血病细胞的迁移能力与细胞表面CXCR4的表达呈正相关，而与细胞的个体大小、生长周期无关。本实验中模型组CXCR4高表达，使用PESV的中高剂量组与模型组比较，小鼠的CXCR4表达有显著差异（P＜0.01），提示此药中高剂量给药时对小鼠CXCR4有明显的影响，低剂量组影响不明显（P＞0.01）。PESV通过下调CXCR4表达，达到抑制白血病细胞转移的作用。

    钙黏蛋白是一类钙依赖性细胞一细胞间黏附分子，参与形成和维持正常细胞间的连接、组织形态以及在胚胎组织分化等方面起重要作用。钙黏蛋白对肿瘤生长和转移具有抑制作用，许多肿瘤的发生及侵袭过程中都发现钙黏蛋白的表达下调、缺失或者功能障碍。在正常骨髓中钙黏蛋白主要表达于CD34+的造血干细胞及骨髓基质细胞，而在白细胞细胞系、32%的急性髓系白血病及53%的急性淋巴细胞白血病出现E-钙黏素的异常甲基化，导致E-钙黏素mRNA及蛋白的表达丧失［11］。本实验中治疗组与模型组相比，其表达具有显著性差异（P＜0.01），高剂量组优于低中剂量组（P＜0.01）。治疗组的肝细胞胞膜上有较多的棕黄色颗粒（见图2～3），这提示肝细胞膜E-钙黏蛋白阳性表达。而模型组肝细胞膜上棕黄色颗粒很少或者没有（见图4），提示E-钙黏蛋白表达很少或缺失。PESV能够增强白血病细胞之间的黏附，维持细胞间连接，使白血病细胞不容易从骨髓中逸出，减少白血病细胞从骨髓中释放的机会，从而降低白血病细胞向髓外播散浸润。模型组表达减少或缺失，使得白血病细胞易于逸出骨髓，产生髓外浸润。
    
　　全蝎是抗肿瘤的常用药，《本草纲目》记载全蝎具有攻毒散结、通络止痛等功效。现代药理研究表明全蝎具有抗肿瘤、镇痛等多种活性。孔天翰等［12］从亚钳蝎蝎毒中提取分离的抗肿瘤有效部位-蝎毒抗癌多肽，能高选择性杀伤多种肿瘤细胞， 并减轻化疗的骨髓抑制等副作用，提高正常组织的免疫活性。经实验研究我们认为PESV通过调节白血病小鼠黏附因子E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4的表达，从而增强相邻白血病细胞的黏附，减少癌细胞从骨髓内逸出到外周血，降低了白血病细胞髓外侵袭浸润的能力，从而达到预防治疗白血病小鼠髓外浸润的目的。白血病浸润转移的机理复杂，此3种黏附因子尚不能完全解释PESV的作用机理，其他方面的机理有待进一步研究探讨。

【参考文献】
  　　［1］王大东.恶性肿瘤转移机制的研究现状［J］.医学综述，1999，5（7）：291.

　　［2］J Hulsken,W Birchmeier,J Behrens.E-cadherin and APC Compete for the interaction with beta-catenin and the cyfoskeleton［J］.J.Cell Biol.1994,127:2061.

　　［3］杨文华，于文俊，史哲新，等.人白血病-NOD/SCID小鼠髓外浸润模型的建立［J］.现代肿瘤医学，2009，17（4）:6.

　　［4］贾莉,孟秀香,孙宏丹.蝎毒对白血病HL-60细胞生长的抑制和诱导凋亡作用研究［J］.中药药理与临床.2001,17(6):26.

　　［5］贾莉,孙宏丹,孟秀香.蝎毒对白血病Raji细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用的研究［J］.白血病·淋巴瘤.2001,10(4):205.

　　［6］贾莉,孙宏丹,孟秀香.蝎毒对人白血病细胞株的抑制作用［J］.大连医科大学学报，2001,23(4):252.

　　［7］万增智，杨文华，史哲新，等. 全蝎诱导HL-60细胞程序性死亡［J］.中药药理与临床，1999,15（1）：20.

　　［8］庄海峰，王伟涛，杨文华．全蝎对人白血病HL-60细胞作用的研究［J］.天津中医药，2005，22（1）：65.

　　［9］Bleul C C.SCH J L，Springer T A． B-lymphocyte chemotaxis regulated in association with microanatomic localization differentiation state and B cell receptor engagement［J］.J Exp Med，1998，187(5)：753.

　　［10］Voermans C， Heese V， JONG I， el al． Migratory behavior of leukemic ceils from acute myeloid leukemia patients［J］.Leukemia，2002，16(4)：650.

　　［11］饶青.黏附分子在炎症与血液肿瘤中的作用［J］.白血病·淋巴瘤,2005,14(5):283.

　　［12］孔天翰,董伟华,郑智敏,等.马氏钳蝎蝎毒对艾氏腹水癌(EAC)小鼠和 Hela 细胞株的作用［J］.河南医科大学学报，1993,4:298.