不同来源降香中柚皮素与异甘草素含量的高效液相色谱测定

【摘要】  目的建立高效液相色谱（HPLC）法测定降香中柚皮素和异甘草素含量的方法，比较不同来源的11批降香药材中的柚皮素和异甘草素的含量。方法采用HPLC法测定，以甲醇-0.2%磷酸水(60∶40) 为流动相，检测波长为372nm（柚皮素）和290 nm（异甘草素）。结果柚皮素在0.948～4.740 μg范围内线性关系良好，r=0.999 9；异甘草素在1.432～10.024 μg范围内线性关系良好，r=0.999 9。降香中的柚皮素含量在2.585～5.429 mg/g之间；异甘草素含量在7.526～28.329 mg/g之间。结论不同来源的降香药材中的柚皮素和异甘草素含量差异较大。该方法操作简便、快速、重复性好，适用于降香的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法； 降香； 柚皮素； 异甘草素

　降香Lignum dalbergiae Odoriferae主要含有挥发油和黄酮类成分。《中国药典》中对于降香的质量控制仅限于规定降香醇溶性浸出物不得少于8.0%［1］，但是对单一成分未有明确的定量方法。本课题组对降香黄酮类成分进行了研究，从中分离得到7个化合物［2］。本文用自制的柚皮素和异甘草素为指标，建立HPLC含量测定方法，并测定了11个不同来源的降香药材中的柚皮素和异甘草素含量。

　　1  仪器与试药
    
　　Waters高效液相色谱仪（四元泵，二极管阵列检测器，自动进样）；柚皮素、异甘草素对照品（实验室自制，经UV、1H-NMR鉴定结构，HPLC检测，面积归一化法计算，纯度大于98%）；甲醇为色谱纯、乙醇等试剂为分析纯。
    
　　本实验所用降香样品的来源见表1。表1  不同来源降香样品（略）

　　2  方法与结果

　　2.1  对照品溶液的制备精密称取柚皮素对照品4.74 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为0.948 mg/ml溶液，再经0.45 μm滤膜滤过得柚皮素对照品溶液。
    
　　精密称取异甘草素对照品7.16 mg于5 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度为1.432 mg/ml溶液，再经0.45 μm滤膜滤过得异甘草素对照品溶液。

　　2.2  供试品溶液的制备按照正交实验的结果，精密称取各样品粗粉2 g，在90℃下用70%乙醇提取3次，1.5 h/次，合并提取液，蒸干。残留物用70%乙醇溶解并定容至25   ml。经0.45 μm滤膜滤过得供试品溶液。

　　2.3  HPLC含量测定

　　2.3.1  色谱条件色谱柱为迪马公司Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；流动相为甲醇-0.2%磷酸水(60∶40)；体积流量为1.0 ml/min；柚皮素的检测波长为372 nm，异甘草素的检测波长为290 nm；进样量为10 μl；柱温30℃。

　　2.3.2  检测波长的确定 紫外扫描柚皮素对照品溶液显示其最大吸收在372 nm处，异甘草素对照品溶液最大吸收为290 nm。因此以此波长作为含量测定的检测波长。

　　2.3.3  线性关系考察柚皮素工作曲线：按“2.3.1”项下色谱条件，分别吸取柚皮素对照品溶液1，2，3，4，5 μl进样测定，记录峰面积，结果见表2。以峰面积×10-6为纵坐标，样品量为横坐标绘制标准曲线并计算得回归方程为Y=5.570 6X -1.8206，r=0.999 9，线性范围是0.948～4.740 μg。表2  柚皮素进样量与峰面积（略）
    
　　异甘草素工作曲线：按“2.3.1”项下色谱条件，分别吸取异甘草素对照品溶液1，2，3，4，5，7 μl进样测定，记录峰面积。结果见表3。以峰面积×10-6为纵坐标，样品量为横坐标绘制标准曲线并计算得回归方程为Y=3.521 8X -1.575 2，r=0.999 5，线性范围是1.432～10.024 μg。表3  异甘草素进样量与峰面积（略）

　　2.3.4  精密度考察精密吸取柚皮素对照品溶液5μl，按“2.3.1”项下色谱条件测定其峰面积，连续操作7次。测定结果为 =4.685μg，RSD=0.61%(n=7)。说明仪器精密度良好。

2.3.5  稳定性考察精密吸取降香供试品溶液5 μl，在0，1，3，6，12 h，按“2.3.1”项下色谱条件测定柚皮素和异甘草素的峰面积，分别以柚皮素和异甘草素工作曲线计算。柚皮素的测定结果为 =4.668 μg，RSD=0.47%(n=5)，提示样品中柚皮素含量在12 h内稳定。异甘草素测定结果为 =7.092 μg，RSD=1.01%(n=5)，提示样品中异甘草素含量在12 h内稳定。结果见表4。表4  柚皮素和异甘草素稳定性考察（略）

　　2.3.6  重复性考察取同一号样品5份，按供试品溶液制备方法平行处理，依法测定，求得RSD为1.43%。说明该方法重复性良好。

　　2.3.7  各样品的含量测定精密吸取样品溶液10 μl，按“2.3.1”项下色谱条件测定柚皮素的峰面积，以柚皮素的工作曲线计算各样品中的柚皮素含量，同样测定异甘草素的峰面积，以异甘草素的工作曲线计算各样品中的异甘草素含量。结果见表5。表5  各样品中柚皮素和异甘草素含量（略）
    
　　本实验对11个市售降香药材的分析表明，降香中的柚皮素含量在2.585～5.429 mg/g之间，异甘草素含量在7.526～28.329 mg/g之间。
    
　　降香样品（以样品1为例）在372 nm和290 nm下的HPLC图谱见图1～2。

　　3  讨论
    
　　降香中含有多种黄酮类成分。其中，本实验已分离出的柚皮素和异甘草素含量较大且其药理活性与降香药材的药理作用相似，故选用这两种化合物为指标测定含量，为降香的质量控制奠定理论基础。
    
　　通过正交设计实验对提取总黄酮的次数、时间、温度和乙醇浓度进行了考察，确定了本文的提取方法。
    
　　本实验选用的两种对照品异甘草素和柚皮素经紫外扫描分别在290 nm和372 nm处有最大吸收。使用PDA检测器，得到200～400 nm范围内的全波长图谱，分别选取290 nm和372 nm下的HPLC分离得到的紫外吸收图谱，建立各自的工作曲线，并测定相应波长下的峰面积从而定量。
    
　　选择流速1.0 ml/min，调整甲醇、水的比例，发现当两者比例为6∶4时分离较好，但是峰形不够好。所以在流动相中加入一定比例的磷酸，当流动相为甲醇-0.2%磷酸水(60∶40)时，异甘草素和柚皮素的峰均能较好的与其他峰实现分离。
    
　　实验表明降香药材中的异甘草素含量高于柚皮素含量。从广西购入的降香中柚皮素与异甘草素含量均较高。实验结果显示不同来源的降香药材中柚皮素与异甘草素的含量差异较大。
    
　　本研究建立了HPLC法测定降香中柚皮素和异甘草素含量的方法，该方法线性关系及重现性良好，方法稳定准确，操作简便。

【参考文献】
  　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:158.

　　［2］郭丽冰，王蕾.降香中黄酮类化学成分研究［J］.中草药，2008，39(8):1147.