HPLC法测定恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量
【摘要】 目的 建立恒古骨伤愈片中橙皮苷含量的检测方法。方法 采用高效液相色谱法,Shim-pack-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)为流动相,检测波长283 nm。结果 橙皮苷线性范围为0.194～0.970 μg,r＝0.999 9,橙皮苷的平均回收率为98.50%,RSD＝0.63%。结论 该方法用于测定恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量,具有简便、准确、灵敏的特点,可作为该制剂质量控制的指标。
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【关键词】 恒古骨伤愈片；橙皮苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To determine the content of Hesperidin in Henggu Gushangyu Tablets by high performance liquid chromatography. Methods The determination was conducted on Shim-pack-C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid water (20∶80). The detection wavelength was 283 nm. Results Good linear relationship of Hesperidin between area and amount was noted for 0.194～0.970 μg, with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery was 98.50%, and RSD was 0.63%. Conclusion The established method is simple, accurate and sensitive, and can be applied to the quality control of the preparation.
Key words：Henggu Gushangyu Tablets；Hesperidin；HPLC；content determination
恒古骨伤愈片是由中成药恒古骨伤愈合剂(收载于《国家中成药标准汇编 骨伤科分册》)改变剂型而制成的新制剂[1],药味由陈皮、红花、三七等9味中药组成,具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的功效, 用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症等。为控制本品的质量,本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定了恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量,作为其内在质量控制指标之一。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10 AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ-250型超声波处理器。
橙皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号 1107221-200211,HPLC面积归一化法,测定含量为99.99%)；恒古骨伤愈片由吉林万德制药有限公司提供(批号20080401, 20080402,20080403,20080501,20080502,20080503,20080504, 20080505,20080506,2008057)。其他所用化学试剂均为国产AR级。
2 方法与结果
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2.1 色谱条件
色谱柱：Shim-pack-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：283 nm；理论塔板数按大黄素计算不低于5 000；柱温为室温[2]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL约含0.05 mg的溶液,即对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20片,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声提取(功率180 W、频率60 kHz)30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方量制备不含陈皮药材的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定。结果表明,阴性对照溶液色谱图中与对照品相应位置处无干扰,此法可行(见图1)。
2.5 线性关系考察
精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.048 5 mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,测定其峰面积。以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归,得到回归方程为：Y＝1 008 770.377X＋25 623.859,r＝0.999 9,结果表明,橙皮苷在0.194～0.970 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取供试品溶液连续5次重复进样,测得橙皮苷峰面积RSD＝0.57%。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液在0、2、4、6 h分别进样,进行测定。结果橙皮苷峰面积RSD＝0.47%,表明在6 h内供试品溶液中橙皮苷含量稳定。
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2.8 重复性试验
精密称取同一批号样品5份,按供试品溶液的制备方法制备,依法进样分析,结果样品中橙皮苷含量RSD＝0.50%,表明其重复性良好。
2.9 加样回收率试验
精密称取橙皮苷对照品适量,加入到已测知橙皮苷含量的恒古骨伤愈片样品(批号20080401,橙皮苷含量3.081 5 mg/g)中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,制得供试品溶液,进样5 μL,测定并计算回收率。结果平均回收率为98.5%,RSD＝0.63%。见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.10 样品测定
按上述方法,制备供试品溶液,测定10批恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量。测定结果表明,恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量基本稳定,暂定为每片含橙偿皮苷含量不得少于1.40 mg。结果见表2。表2 恒古骨伤愈片中橙皮苷含量测定结果（略）
3 讨论
有关橙皮苷的HPLC含量测定方法较多,流动相采用乙腈、甲醇、水、冰醋酸等系统[3-4]。我们通过摸索,采用乙腈、磷酸水系统,色谱分离效果较为满意,分离度及峰形对称性较好。
待测成分橙皮苷易溶于甲醇,故采用甲醇溶剂提取。对供试品提取方法的考察采用加热回流提取和超声提取,测定结果分别为3.812、3.810 mg/g,两种方法制得的供试品中橙皮苷含量无差异,均可使橙皮苷提取完全。为了简化操作,故选用超声提取制备供试品溶液。本试验对超声提取时间进行了考察,分别以20、30、40 min进行超声提取,测定结果分别为3.652、3.811、3.813 mg/g,超声提取30 min以上,可使橙皮苷充分浸出,为了缩短检测时间,故确定超声提取时间为30 min。
【参考文献】会计论文发表
[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编 骨伤科分册[S].2002.320.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.132.
[3] 张立峰,赵国强,刘灿仿,等.高效液相色谱法测定康儿灵颗粒中橙皮苷的含量[J].西北药学杂志,2008,23(2)：70.
[4] 王举涛,陈 明,刘丛彬,等.HPLC测定养胃舒软胶囊中橙皮苷的含量[J].中成药,2008,30(2)：309.
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【关键词】 恒古骨伤愈片；橙皮苷；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To determine the content of Hesperidin in Henggu Gushangyu Tablets by high performance liquid chromatography. Methods The determination was conducted on Shim-pack-C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phase of acetonitrile-0.4% phosphoric acid water (20∶80). The detection wavelength was 283 nm. Results Good linear relationship of Hesperidin between area and amount was noted for 0.194～0.970 μg, with a correlation coefficient of 0.999 9. The average recovery was 98.50%, and RSD was 0.63%. Conclusion The established method is simple, accurate and sensitive, and can be applied to the quality control of the preparation.
Key words：Henggu Gushangyu Tablets；Hesperidin；HPLC；content determination
恒古骨伤愈片是由中成药恒古骨伤愈合剂(收载于《国家中成药标准汇编 骨伤科分册》)改变剂型而制成的新制剂[1],药味由陈皮、红花、三七等9味中药组成,具有活血益气、补肝肾、接骨续筋、消肿止痛、促进骨折愈合的功效, 用于新鲜骨折及陈旧骨折、股骨头坏死、骨关节病、腰椎间盘突出症等。为控制本品的质量,本试验采用高效液相色谱(HPLC)法测定了恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量,作为其内在质量控制指标之一。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10 AT高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；KQ-250型超声波处理器。
橙皮苷对照品购于中国药品生物制品检定所(批号 1107221-200211,HPLC面积归一化法,测定含量为99.99%)；恒古骨伤愈片由吉林万德制药有限公司提供(批号20080401, 20080402,20080403,20080501,20080502,20080503,20080504, 20080505,20080506,2008057)。其他所用化学试剂均为国产AR级。
2 方法与结果
会计论文发表
2.1 色谱条件
色谱柱：Shim-pack-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水(20∶80)；流速：1 mL/min；紫外检测波长：283 nm；理论塔板数按大黄素计算不低于5 000；柱温为室温[2]。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL约含0.05 mg的溶液,即对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
取本品20片,研细,取约0.3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,超声提取(功率180 W、频率60 kHz)30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,即得。
2.4 阴性对照溶液的制备
按处方量制备不含陈皮药材的阴性样品,按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL,注入液相色谱仪中,按上述色谱条件测定。结果表明,阴性对照溶液色谱图中与对照品相应位置处无干扰,此法可行(见图1)。
2.5 线性关系考察
精密称取橙皮苷对照品适量,加甲醇制成每1 mL含橙皮苷0.048 5 mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液4、8、12、16、20 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图,测定其峰面积。以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归,得到回归方程为：Y＝1 008 770.377X＋25 623.859,r＝0.999 9,结果表明,橙皮苷在0.194～0.970 μg范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
精密吸取供试品溶液连续5次重复进样,测得橙皮苷峰面积RSD＝0.57%。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液在0、2、4、6 h分别进样,进行测定。结果橙皮苷峰面积RSD＝0.47%,表明在6 h内供试品溶液中橙皮苷含量稳定。
会计论文发表
2.8 重复性试验
精密称取同一批号样品5份,按供试品溶液的制备方法制备,依法进样分析,结果样品中橙皮苷含量RSD＝0.50%,表明其重复性良好。
2.9 加样回收率试验
精密称取橙皮苷对照品适量,加入到已测知橙皮苷含量的恒古骨伤愈片样品(批号20080401,橙皮苷含量3.081 5 mg/g)中,精密加入甲醇50 mL,称定重量,超声提取30 min,取出,放冷,再称定重量,加甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,制得供试品溶液,进样5 μL,测定并计算回收率。结果平均回收率为98.5%,RSD＝0.63%。见表1。表1 加样回收率试验结果（略）
2.10 样品测定
按上述方法,制备供试品溶液,测定10批恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量。测定结果表明,恒古骨伤愈片中橙皮苷的含量基本稳定,暂定为每片含橙偿皮苷含量不得少于1.40 mg。结果见表2。表2 恒古骨伤愈片中橙皮苷含量测定结果（略）
3 讨论
有关橙皮苷的HPLC含量测定方法较多,流动相采用乙腈、甲醇、水、冰醋酸等系统[3-4]。我们通过摸索,采用乙腈、磷酸水系统,色谱分离效果较为满意,分离度及峰形对称性较好。
待测成分橙皮苷易溶于甲醇,故采用甲醇溶剂提取。对供试品提取方法的考察采用加热回流提取和超声提取,测定结果分别为3.812、3.810 mg/g,两种方法制得的供试品中橙皮苷含量无差异,均可使橙皮苷提取完全。为了简化操作,故选用超声提取制备供试品溶液。本试验对超声提取时间进行了考察,分别以20、30、40 min进行超声提取,测定结果分别为3.652、3.811、3.813 mg/g,超声提取30 min以上,可使橙皮苷充分浸出,为了缩短检测时间,故确定超声提取时间为30 min。
【参考文献】会计论文发表
[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编 骨伤科分册[S].2002.320.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.132.
[3] 张立峰,赵国强,刘灿仿,等.高效液相色谱法测定康儿灵颗粒中橙皮苷的含量[J].西北药学杂志,2008,23(2)：70.
[4] 王举涛,陈 明,刘丛彬,等.HPLC测定养胃舒软胶囊中橙皮苷的含量[J].中成药,2008,30(2)：309.
