大肠埃希菌表达的含PTD穿膜序列的融合 蛋白3种复性方法比较

【摘要】  目的： 探索融合蛋白PTD?NFATminiDBD?eGFP纯化以及复性的条件，以提高其复性效率，为后续融合蛋白生物学功能的研究做准备。方法： 表达、提取并纯化包涵体形式的融合蛋白PTD?NFATminiDBD?eGFP，分别用稀释复性、透析复性、柱上复性的方法，对融合蛋白进行复性，分析不同方法的特点及包涵体复性率，采用流式细胞术检测融合蛋白的穿膜活性。结果： 3种复性方法得到的融合蛋白复性率依次为：柱上复性得率最高，其次是透析复性，稀释复性得率最低。柱上复性后蛋白的穿膜效率最高，相对较低的是稀释复性，而未复性的融合蛋白穿膜效率极低。结论： 3种复性方法均能对PTD穿膜蛋白复性，但以柱上复性最佳。 学术论文发表

【关键词】  蛋白转导域 复性 包涵体

    ［Abstract］  Objective: To investigate the renaturation parameters of inclusion bodies of the fusion protein PTD?NFATminiDBD?eGFP and to improve the refolding efficiency for the further research of its bio?function in T cells.Methods： Expressed, extracted and purified the fusion protein PTD?NFATminiDBD?eGFP and renaturated it by dilution, dialysis and refolding via Immol/Lobilized Metal?Ion?A ffinity Chromatography（IMAC), respectively.A flow cytometry assay was used to detect the effect of the fusion protein to transduce into the cells cytoplasm. Results： The fusion protein could be refolded by different renaturation ways.The lowest and highest refolding yields could be obtained by dilution and refolding via IMAC, respectively.The flow cytometry analysis indicated that the renaturated protein could transduce into Jurkat cells efficiently and the denaturation protein had low activity. Conclusion： The fusion protein PTD?NFATminiDBD?eGFP was refolded successfully by the three methods.Moreover, refolding via IMAC was the best one for PTD?NFATminiDBD?eGFP fusion protein.

    ［Key words］  protein transduction domain;  refolding;  inclusion bodies(IBS)

    蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）是近年来发现的由HIV基因编码的具穿膜功能的反式激活蛋白(trans?activator transcription,TAT)中一段富含碱性氨基酸，带较多正电荷的多肽，它能够有效地引导与之共价相连的核酸、多肽、蛋白质等进入细胞。这种转导不依赖受体和转运蛋白，也不涉及温度和能量转换，且转导速度快，效率高［ 1,2 ］，具有广谱的蛋白转导作用。外源性重组蛋白在大肠埃希菌中的高效表达率，使得蛋白不能形成正确折叠而以不溶性包涵体形式存在。包涵体形式表达的重组蛋白只有通过复性才能得到有生物学活性的蛋白质。然而，不同的蛋白质结构和理化性质差异很大，对不同的变性剂和复性液的反应也不尽相同［ 3-5 ］，因此，需要通过试验摸索出适合自身蛋白复性的方法。本文通过试验研究了不同复性方法的蛋白得率和复性后蛋白的穿膜效率，并比较了不同方法的特点，现报告如下。学术论文发表

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    pQE30? PTD?NFAT miniDBD?eGFP原核表达载体由我室构建，工程菌E.coli M15，Jurkat细胞为我室保存；纯化树脂Profinity IMAC金属螯合填料购自Bio?Rad公司；鼠抗-6×His单克隆抗体购于Cell Signaling公司，HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗以及DAB显色剂购于北京中杉公司；蛋白分子量标准参照物购于Fermentas公司；还原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、IPTG购自南京建成生物公司，其余试剂均为进口或国产分析纯。结合缓冲液：50 mmol/L NaH2PO4,300  mmol/L NaCl,5 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；洗涤缓冲液：50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；洗脱缓冲液：50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,8 mol/L尿素；复性稀释液：50 mmol/L NaH2PO4,100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,0.25% NP?40,4 mol/L尿素,调整pH至8.0；透析复性液：尿素(6 mol/L,4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L,0 mol/L),20  mmol/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,0.25% NP?40,调整pH至8.0；复性缓冲液：尿素(6 mol/L,4 mol/L,3 mol/L,2 mol/L,1 mol/L,0.5 mol/L,0 mol/L)，50 mmol/L NaH2PO4,100 mmol/L NaCl,20 mmol/L Tris·HCl,1 mmol/L EDTA,0.25% NP?40,调整pH至8.0。

    1.2  方  法

    1.2.1  细菌的培养与诱导表达  将37 ℃，250 r/min 培养过夜的菌液按照1∶100体积比接种于新鲜的含0.1 g/L氨苄西林和0.025 g/L卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养至D(600 nm)为0.6～0.8，此时取1 ml菌液，离心收集菌体，置于-20 ℃以下冰箱内冻存，作为诱导前阴性对照，其余部分加入终浓度为1 mmol/L的IPTG继续在上述条件下培养6 h。将每100 ml的LB液体培养基诱导的菌体用pH 7.4的PBS洗涤2次，离心收集菌体，称重后备用。

    1.2.2  融合蛋白的纯化  取一份备用的菌体，按Profinity IMAC金属螯合填料的使用说明：以含8 mol/L尿素的结合缓冲液与收集的菌体湿重之比为10 ml∶1 g加入结合缓冲液，反复冻融3次后冰浴中超声裂解，离心收集上清，过滤，加入含有1 ml填料的平衡柱中，用含有20 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗涤，待流出液D(280 nm)趋近于0时，加入含有250 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液即为目的蛋白，用Bradford测定蛋白浓度。

    1.2.3  3种方法复性融合蛋白

    1.2.3.1  稀释复性  将上述纯化的变性蛋白逐滴加入复性稀释液(临用前加入0.2 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH，0.6 mol/L L?精氨酸)，使蛋白终浓度在0.05～0.1 g/L范围，于4℃低速搅拌复性24 h以上，再用PBS透析过夜。在4℃用吹干法或PEG20000浓缩蛋白，10 000 r/min，离心15 min，收集上清测浓度。

    1.2.3.2  透析复性［6］  将纯化的目的蛋白，调整浓度为0.1～1 g/L装入透析袋，置于20倍蛋白液体积的透析复性液(临用前加入0.2 mmol/L PMSF，0.2 mmol/L GSSG，2 mmol/L GSH，0.6 mol/L L?精氨酸，10%甘油，1%蔗糖，0.1%PEG 8000)中，每12 h更换透析复性液1次，按照6，4，3，2，1，0.5，0 mol/L的梯度依次降低尿素的浓度，最后用PBS透析过夜，浓缩方法如上。

    1.2.3.3  柱上纯化和复性［7］  取一份准备好的包涵体蛋白，与上述包涵体蛋白纯化步骤类似，所不同的是在流出液D(280 nm)趋近于0时，再加入含不同浓度尿素的复性缓冲液，使得尿素的浓度缓慢降低至0，最后加入不含尿素的洗脱缓冲液(其余成分不变)收集目的蛋白。第二种柱上复性的方法是根据在透析复性过程中，当透析复性液中尿素的浓度从2 mol/L变为1 mol/L时开始出现明显的絮状沉淀物，确定融合蛋白的重折叠的关键点在尿素浓度为2 mol/L左右。因此，我们取一份备用的菌体，根据比例加入含2 mol/L尿素的结合缓冲液(其余成分不变)，超声裂解后离心，将上清加入含2 mol/L尿素的结合缓冲液平衡后的柱中，用含2 mol/L尿素洗涤缓冲液(其余成分不变)洗涤至流出液D(280 nm)趋近于0时，加入复性缓冲液(其余成分不变，尿素浓度梯度改为2，1.5，1，0.5，0 mol/L)使得尿素的浓度缓慢降低至0，然后用不含尿素的洗脱缓冲液(其余成分不变)收集目的蛋白。

    1.2.4  融合蛋白鉴定及浓度测定  用Bradford测定蛋白浓度，SDS?PAGE,蛋白质印迹法鉴定表达的和纯化复性后的蛋白。

    1.2.5  融合蛋白穿膜活性检测  将复性前和复性后的融合蛋白以2 μmol/L的浓度与5×105的Jurkat细胞共同孵育4 h，收集细胞，并用PBS洗两次，用流式细胞仪检测融合蛋白的穿膜效果。学术论文发表

   2  结  果

    2.1  表达产物的鉴定

    经12% SDS?PAGE电泳分析，宿主菌用IPTG诱导后的总菌体蛋白电泳图谱与诱导前阴性对照比较，在分子量约53 kD处出现一条较粗的蛋白带(见图1a)，与预计的PTD?NFAT miniDBD?eGFP蛋白分子量大小相符，且大部分以包涵体的形式存在。

    2.2  不同复性方法所得蛋白浓度及复性得率

    经树脂Profinity IMAC纯化后复性前的蛋白总量为3.1 mg。稀释复性后蛋白总量为0.537 mg，复性率为17.3%；透析复性后蛋白总量为0.92 mg，复性率为30%；两种柱上复性后测得蛋白总量分别为1.025和1.295 mg，复性率分别为33%和41.7%。

    2.3  复性后融合蛋白的鉴定

    纯化后与复性后的PTD?NFAT miniDBD?eGFP融合蛋白经12% SDS?PAGE电泳分析可见，目的蛋白无论是在变性还是复性条件下，位置一致且均为单一的1条带(图1b)。蛋白质印迹法分析显示，复性后的蛋白与总菌体蛋白位置一致(图2)。

    2.4  不同复性方法所得融合蛋白穿膜效应

    复性后的融合蛋白经流式细胞仪检测，结果显示：PTD?NFAT miniDBD?eGFP融合蛋白能够进入Jurkat细胞，且3种不同复性方法得到的融合蛋白在同样条件下穿膜效应以柱上复性方法2最高，稀释复性效率相对较低，而未复性的蛋白穿膜能力最弱(图3)。学术论文发表

    3  讨  论

    　　重组蛋白在大肠杆菌高效表达时，往往以不溶的、无活性的包涵体形式存在于细胞内。包涵体形式的重组蛋白需要复性才能得到有生物学活性的蛋白质。蛋白质复性是蛋白的折叠与聚集竞争的过程，是蛋白质研究中面临的最大困难。这个过程一方面受到复性条件的影响例如变性剂、蛋白性质和浓度、复性液pH值和温度、氧化还原环境、离子强度、助溶剂和时间等［ 3,8-11］；另一方面也受到不同复性方法的影响。本文运用了3种不同的方法对融合蛋白进行复性，结果发现柱上复性蛋白得率和穿膜效率最高，稀释复性蛋白得率和穿膜效率最低。稀释复性和透析复性耗时较长(通常48～96 h)，蛋白长期在4 ℃致使生物活性容易损失或丧失；而柱上复性可以使纯化和复性一步完成，快速简单，缩短了操作时间。另外，根据蛋白的折叠关键点，我们运用了两种柱上复性的方法，其主要区别是变性剂的起始浓度一个是8 mol/L尿素，一个是2 mol/L尿素。尿素是一种较弱的变性剂，它通过离子间的相互作用，打开包涵体蛋白质分子的各种化学键，使多肽伸展。对PTD?NFAT miniDBD?eGFP而言，2 mol/L尿素对蛋白的变性作用较小，去除尿素后，蛋白可以复性且蛋白复性效率和穿膜效率最好。在高浓度尿素(8 mol/L)的强碱性环境下，目的蛋白变性程度大，去除尿素后，蛋白复性效果相对前者差。此外，柱上复性一次复性的蛋白总量小，耗时短，蛋白的浓度变化不大，生物学活性不易破坏；稀释复性和透析复性一次复性的蛋白量大，耗时长，需要超滤系统浓缩，并且浓缩过程大大增加了蛋白重新聚集变性的风险。因此，对于这种带穿膜序列的蛋白，在小规模复性研究其生物学活性时，用2 mol/L尿素作为变性剂进行柱上复性效果最好，操作简易；在大规模生产，设备齐全的情况下，可以选择透析复性，得率较高，蛋白活性较强。学术论文发表