养精种玉汤对CHL细胞株染色体畸变影响研究
【摘要】 目的探讨养精种玉汤对CHL细胞株染色体畸变的影响，对其遗传安全性进行研究。方法采用CHL细胞培养技术，设养精种玉汤不同剂量对CHL细胞进行体外染毒，观察其致CHL细胞株染色体数目及结构变化。结果在5 000，2 500，1 250 μg/ml不同测试剂量浓度下，无论24 h及48 h收集细胞，并在+S9与-S9两种测试条件下，进行染色体畸变分析，各剂量组、溶剂对照染色体畸变率均在正常范围。结论养精种玉汤在实验所确定的5 000 μg/ml测试剂量浓度以下，初步认为无诱发CHL染色体畸变作用。
【关键词】 养精种玉汤 遗传毒性 CHL细胞染色体畸变试验
Abstract：ObjectiveTo observe the effects of Yang Jing Zhong Yu Decoction on CHL chromosomal aberration.MethodsThe CHL cell was poisoned by Yang Jing Zhong Yu Decoction at different doses in vitro with cell training techniques,chromosomal variety of CHL was observed.ResultsAll the CHL chromosomal aberration rates were normal for Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentrations of 5 000,2 500,1 250 μg/ml，and collecting time points after 24h and 48h，mixing into S9 or non-mixing into S9 in all Yang Jing Zhong Yu Decoction groups. ConclusionThe experiment effects indicate that it has no genetic toxicity of Yang Jing Zhong Yu Decoction at the concentration of 5 000 μg/ml.
Key words：Yang Jing Zhong Yu Decoction; Genetic toxicity; CHL chromosomal aberration test
养精种玉汤乃清代山西太原府名医傅山所创，出自《傅青主女科》，原为治疗身瘦不孕，后经多年来临床医家们的反复实践与锤炼，现已演绎成为治疗不孕症的基础方。养精种玉汤广泛用于种子期,其药效已较为肯定,但其临床运用安全性研究至今未见详细报道，并缺乏临床运用后安全性流行病学调查资料。鉴于此，本研究通过其不同剂量对CHL细胞株体外染毒，进行遗传毒性测定,以期获得其继药效学之后的临床前毒效学资料，为其种子期合理和安全应用提供实验学依据。
1 材料与仪器
1.1 药液制备对所需中药材的来源及品种进行鉴定，筛选优质正品，原料经品种鉴定无误后，再进行挑选和洗净，然后炮制、切片、烘干、粉碎。严格按照经典处方比例用量配备，采用制备工艺如下：① 取经加工炮制的标准中药饮片（白芍、山茱萸）用70%乙醇回流提取2次，1 h/次，合并提取液滤过，回收乙醇;②其余药与白芍、山茱萸药渣混合，水液煎煮2次，1.5 h/次，合并滤液，滤过滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2（50～60℃），加入乙醇使醇含量达65%，冷藏24 h，醇液滤过，滤液回收乙醇，至无醇味；③ 以上两液合并，冷藏放置，视无沉淀析出；④ 添加蒸馏水，调pH值至6.5～7.0, 并调整至相当于含生药2 g/ml；⑤ 精滤、灌封、灭菌即得。
1.2 细胞株中国仓鼠肺细胞（CHL）由中国药品生物制品鉴定所提供。由液氮冷冻保存。采用细胞培养基为F12培养液补加10%胎牛血清，在37℃、5%CO2、饱和湿度环境中培养。
1.3 试剂与仪器HAM F12培养基：GIBCO公司出品；胎牛血清：北京元亨金马出品；DMSO：北京化学试剂公司出品；天平：瑞士METTLER TOLEDO AL204DU-IC型；生物安全柜：美国Labconco DELTA型；恒温摇床：上海智城ZHWY-200B型。
1.4 阳性对照剂间接诱变剂为环磷酰胺（Cyclophosphomide），代号CP，来源于上海华联制药有限公司/011204，外观为白色粉剂，用生理盐水配制成20 mg·ml-1母液，现用现配，稀释成50 μg·ml-1应用液。直接诱变剂为丝裂霉素C(Mitomycin C),代号MMC，来源于Kyowa Hakko Kogyo Co.ltd/333AJG，外观为灰色粉剂，用生理盐水配制成200 μg·ml-1母液，现用现配，稀释成25 μg·ml-1应用液。
2 方法 2.1 S9活化系统制备取体质量160～200 g的健康Sprague-Dawley SPF/VAF大鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001。腹腔注射多氯联苯玉米油溶液，5 d后颈椎脱臼处死，制备肝匀浆。匀浆以9 000 g离心取上清液(S9)分装,液氮冷冻保存;临用时，取S9进行S9混合液配制。 2.2 分组依据预实验采用MTT方法观察养精种玉汤不同浓度对CHL细胞生长的抑制作用结果，设3个剂量组浓度分别为5 000，1 500，1 250 μg/ml。同时设溶剂对照、S9对照及阳性诱变剂对照。 2.3 操作步骤及检测指标①取处于对数生长期的CHL细胞培养体系，正常对照或3个剂量组分别加入相应剂量的应用液，加样体积均为40 μl，阳性对照按照各自的浓度要求加入适当体积的溶液。其中，在-S9mix的条件下，不同浓度药物的作用时间各取两个时间点，即24 h和48 h；+S9mix 时药物作用于细胞的时间为6 h，然后换新鲜培养液继续培养24 h和48 h。②终止培养前2 h秋水仙碱处理; 0.25%胰蛋白酶液消化;离心管离心;低渗液低渗;固定液固定;离心,重复1次;滴片,酒精灯上干燥;10%Giemsa 染色制片。③指标检测，每个浓度组至少观察100个中期分裂相，在油镜下分别记录细胞染色体的数量变化及畸变类型，然后根据畸变细胞数算得畸变率。结构畸变包括染色体型畸变和染色单体畸变，畸变类型包括断裂、缺失、易位、双着丝点和环等。 2.4 统计学分析采用SAS 9.13版软件由计算机完成，计数资料进行χ2检验。 3 结果 直接诱变剂丝裂霉素C（MMC）在25 μg/ml浓度下,CHL细胞染色体畸变率显著增高至60%，间接诱变剂环磷酰胺（CP）在50 μg/ml浓度下，并在S9活化条件下染色体畸变率显著增高至70%，而溶剂对照组在+S9及-S9两种测试条件下,染色体结构畸变率均小于5%，且阳性对照与溶剂对照相比具有统计学意义上的增加（P＜0.01）。养精种玉汤剂量在1 250～5000 mg/ml不同浓度范围内，在S9活化和非活化两种测试条件下，无论24 h或48 h收获CHL细胞,进行染色体畸变分析，染色体畸变率也在正常范围，并与溶剂对照比较无显著性差异(P＞0.05)。见表1。表1 养精种玉汤对CHL细胞染色体畸变影响（略） 4 讨论 染色体是一条双螺旋结构的DNA链和比较松散地结合在蛋白质上的复合物。它是遗传单位基因的载体，具有独特的形态和结构，当受到外界诱变物作用时易出现损伤，即在形态及结构上发生畸变。染色体畸变的机制比较复杂，一般认为，诱变物主要作用于细胞分裂周期G1期，此时染色体尚未复制，易导致染色体损伤产生畸变。由于CHL细胞株的不同世代之间，在细胞周期时间和克隆形成率等参数上没有明显差异，便于控制实验条件，且不受动物体内营养及生理、免疫状态影响，因而能定量研究，重复性也好，且能传代保存，便于进行形态学和超微结构等观察，并进行细胞化学、生物化学等分析。CHL染色体畸变试验是体外细胞培养染色体正向突变实验［1］，不但能判定染色体数目异常，尚能判定染色体结构变化。养精种玉汤作为助孕名方，备受历代医家所重视。本文采用CHL细胞培养方法，直接诱变剂MMC在-S9条件,CHL细胞染色体畸变率显著增高至60%，间接诱变剂CP在+S9条件下染色体畸变率显著增高至70%，而溶剂对照在+S9及-S9两种测试条件下,染色体结构畸变率均小于5%，且阳性对照与溶剂对照相比具有统计学意义上的增加（P＜0.01），这说明试验系统可信。对养精种玉汤设5 000，2 500，1 250 μg/ml不同剂量对CHL细胞进行体外染毒，结果无论24 h及48 h收集细胞，并在S9活化与非活化两种测试条件下，进行染色体畸变分析，各剂量组、溶剂对照染色体畸变率均在正常范围，说明其在本实验所确定的5 000 μg/ml以下，初步认为无诱发CHL染色体畸变作用。不过，染色体畸变试验主观因素大，尤其采样时间的把握对试验成败有较大影响，需特殊训练的专业技术人员，因此，建议进一步做体内染毒遗传毒性试验，方能保证实验结果的可靠性。 【参考文献】
［1］Glart H, Bartsch L, Czich A, et a1．Salmonella strains and mammalian cells genetically engineered for expression of sulfotrans-ferases［J］. Toxicol Lett，2004，82/83：829.
