低能量氦-氖激光血管内照射联合中药对实验性糖尿病脑梗死家兔神经元cNOSmRNA水平的…
【摘要】 目的 观察低能量氦-氖激光血管内照射(ILIB)配合中药治疗对实验性糖尿病脑梗死家兔神经元cNOSmRNA的影响。方法 经四氧嘧啶造成糖尿病及光化学方法造成脑梗死的高脂家兔糖尿病脑梗死模型35只,分为模型组、单纯激光照射组、中药(糖脑络通方)治疗组、激光+中药组,检测其神经元cNOSmRNA 水平表达,进行组间比较及与正常组比较。结果 与模型组比较,单纯激光和中药组对cNOSmRNA水平影响不大,而激光联合中药组可显著降低模型家兔神经元紊乱的cNOSmRNA水平,减轻nNOS介导的神经损伤,更有利于梗死后的神经功能恢复。结论 ILIB联合中药糖脑络通方可显著降低模型家兔神经元cNOSmRNA水平的表达,减轻nNOS介导的神经损伤,从而达到治疗糖尿病脑梗死的目的。
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【关键词】 糖尿病；脑梗死；氦-氖激光；糖脑络通；cNOSmRNA
Effect of Intravenous Low Intensity Laser Radiation on cNOSmRNA in Experimentally Modeled Rabbit of Diabetic Stroke WANG Bo, WEI Hai-feng 1.The Second Hospital Attached to The General Hospital of PLA, Beijing 100091, China；2.Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Science, Beijing 100053, China Abstract：Objective To observe the effect of intravenous low intensity laser radiation (ILIB) with traditional chinese medicine on cNOSmRNA of the rabbits of experimental diabetic stroke. Method 35 successfully modeled rabbits, after alloxian injection for diabetes and photochemical radiation for stroke, were randomized into four treatment group：control group, ILIB group, traditional Chinese herb medicines treatment group, and a group with compound treatment of ILIB and TCH. 7 unmodeled rabbits were made as the normal group. The cNOSmRNA level was comparedwith eath other. Results Compared with control group, ILIB group and traditional Chinese herb medicines treatment group can’t significantly rectify the disorderly cNOSmRNA, but E can. Conclusions Group E can effectively reduce the cNOSmRNA level and nervous injury, cure diabetes cerebral infarction. Key words：diabetes mellitus；cerebral infarction；intravenous low intensity laser radiation；Traditional Chinese Medicine；cNOSmRNA 糖尿病患者血液多处于血流变高凝血状态[1-2],血管收缩状态有所改变。以往研究显示,低能量氦-氖激光血管内照射(ILIB)及活血化瘀中药能有效地改善患者及实验动物的血管收缩状态,提高一氧化氮(NO)水平。本实验拟通过观察ILIB及其配合中药治疗对实验性糖尿病脑梗死家兔神经元cNOSmRNA水平的影响,并比较它们的疗效。
1 材料及方法
1.1 仪器 ZJC480型电脑多功能氦-氖激光血管内照射治疗仪,长春中吉光电公司产品。JLT-B冷强光透照仪,河北泊头市医用光电仪器厂产品。1.2 造模 新西兰大白兔53只,购自中国药品生物制品检定所[北京市实验动物许可证,京动许字(2000)第017号总062号],体重2.5 kg左右,适应性喂养2周后,纳入实验。动物称重后随机抽出7只作为正常对照组,其余参考文献[3]造模。家兔禁食8～12 h,经耳缘静脉注射新鲜配制的5%四氧嘧啶生理盐水注射液,初次剂量为120 mg/kg,选取空腹血糖不足11.1 mmol/L者以150 mg/kg剂量注射。
选取经2次造模后空腹血糖在11.1 mmol/L以上者,每只每日给高脂饲料60 g(含1%胆固醇,15%蛋黄粉,5%猪油)加普通饲料喂养。2周后制作脑梗死模型。脑梗死模型：再参考文献[4-5]用光化学方法造成脑梗死。在以3%戊巴比妥钠1 mL/kg体重经耳缘静脉麻醉后,将其头部固定在立体定位仪上,取家兔左侧颅骨中线与冠状缝向后向左各0.6 cm处为中心,纵行切开头皮2 cm。暴露颅骨,用牙科车床锯开1 cm×1 cm大小的骨窗后,经耳缘静脉按1 mL/kg体重注射虎红(Rose Bengal, 3.5%),2 min后用冷强光透照仪经直径为0.7 cm的圆形光导探头由骨窗照射10 min。术区撒青霉素粉适量,局部以牙托粉封闭骨窗,逐层缝合切口。
1.3 分组及给药
将术后造模成功的家兔28只,以其血糖值随机分为模型组、单纯激光组、中药治疗组、激光+中药组各7只,进行以下处理。
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单纯激光组以3%戊巴比妥钠1 mL/kg体重经耳缘静脉麻醉后,经另侧耳缘静脉插入无菌一次性光纤针,经光纤导管连接低能量氦-氖激光血管内照射治疗仪。照射波长632.8 nm,输出功率3 mW。每次1 h,每2日1次,共治疗15次。中药治疗组予糖脑络通方煎剂(主要含黄芪、地黄、水蛭、丹参等)。所给药物均按人-兔等效剂量计算。激光+中药组在单纯激光组给药方法的基础上加用糖脑络通方煎剂。模型组同时灌胃相应体积的生理盐水。此后,各用药组每周测1次体重,根据体重调整给药量。
1.4 观察方法及检测指标
cNOSmRNA测定：cNOSmRNA探针由北京大学医学部病理系制作。取石蜡切片置60 ℃恒温培养箱30 min后浸入二甲苯,梯度乙醇水化,蛋白酶K消化,4%多聚甲醛固定,预杂交42 ℃、30 min(预杂交液：6×SSC,45%去离子甲酰胺,5×Denhardt's液,100 μg/mL变性鲑精DNA),加1 μg/mL变性探针的杂交液,42 ℃杂交20 h,然后分别用6×SSC-45 %去离子甲酰胺,2×SSC,缓冲液Ⅰ(100 mmol/L 马来酸,0.15 mol/L NaCl,pH7.5)和缓冲液Ⅱ(缓冲液Ⅰ 9 mL加封闭液1 mL)洗涤,滴加抗地高辛抗体,反应30 min后用NBT/BCIP显色6 h。显微镜下观察棕褐色阳性杂交信号,直接输入图像分析仪,定量测量各组每张切片。随机选15个海马阳性反应神经元,测定阳性细胞胞浆平均密度(OD),以反映染色程度,以任意单位(Arbitrary Unit)表示,进行比较[6]。
1.5 统计学方法
采用SPSS统计软件进行方差分析,LSD法进行组间比较。
2 结果
2.1 各组海马神经元阳性细胞胞浆平均密度比较
(见表1)表1 各组海马神经元阳性细胞胞浆平均密度(略)注：与正常组比较,★P<0.05；与模型组比较,ΔP<0.05；与单纯激光组比较,#P<0.05；与中药治疗组比较,●P<0.05。
2.2 治疗后各组cNOSmRNA原位杂交结果比较
正常组：海马神经元呈淡紫色,提示cNOSmRNA原位杂交弱阳性。模型组：海马神经元呈紫褐色染色,神经元排列尚整齐,提示cNOSmRNA原位杂交强阳性。单纯激光组：海马神经元呈紫褐色染色,神经元排列不甚整齐,提示cNOSmRNA原位杂交阳性,较模型组弱。中药治疗组：海马神经元排列整齐,cNOSmRNA原位杂交呈浅紫褐色染色,较模型组弱。激光+中药组：海马神经元呈淡紫色,神经元排列整齐,提示cNOSmRNA原位杂交弱性,但较正常组强。
3 讨论
星形胶质细胞胶原酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的特异性标记物可用作鉴定星形胶质细胞。在各种刺激下,星形胶质细胞内GFAP表达的变化是一种表型的改变,可以反映细胞各种分子物质表达(包括蛋白质的合成)的改变及代谢的变化[7-8]。在体的星形胶质细胞GFAP表达的量及其形态特征还可因脑损伤,包括脑缺血等刺激而激活变为星形胶质细胞,可见细胞数目增多,其GFAP表达显著增高,并伴以细胞肥大[7-8]。星形胶质细胞内含有少量固定型(结构型)一氧化氮合酶(cNOS),缺血性脑损伤可诱发星形胶质细胞表达诱生型NOS(iNOS)。因星形胶质细胞在脑内数量巨大,故推测其表达iNOS而产生大量的NO,发挥神经毒性作用。发表论文网站
本实验结果显示,造模后cNOSmRNA在神经元的表达显著增加。中药+激光组可显著降低模型家兔神经元cNOSmRNA水平,减轻nNOS介导的神经损伤,而单纯激光组对cNOSmRNA在神经元的表达改善不明显。说明中药联合激光可以更好减轻nNOS介导的神经损伤,更有利于梗死后的神经功能恢复。
【参考文献】
[1] 曹丙振,樊 红,曲 伸,等.糖尿患者rCBF、血液流变学及血小板功能的研究[J].临床神经病学杂志,1994,7(2)：80－82.
[2] Rampling MW. Haemorheological disturbances in hypertension： the influence of diabetes and smoking[J]. Clin Hemorheol Microcirc 1999,21(3-4)：183－187.
[3] 孟庆棣.八仙长寿汤治疗糖尿病的实验研究[J].中成药研究,1984, (11)：25.
[4] Wester P, Watson BD, Prado R, et al. A photothrombotic ring model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion[J].Stroke,1995,26(3)：444－450.
[5] 石秉霞,徐建林,郭云良,等.光化学脑梗死动物模型建立的实验观察[J].青岛医学院学报,1995,31(2)：90－93.
[6] 徐庆中,段会玲,卢德宏,等.星形细胞瘤的胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白免疫组织化学定量研究[J].中华病理学杂志,1994,23(2)：66－68.
[7] Eddleston M, Mucke L.Molecular profiloe of reactive as–trocytes implications of their role in neurologic disease[J].Neurosci, 1993,34(5)：539－545.
[8] Petito CK, Morgello S, Felix LC, et al. The two patterns of reactive astrocytosis in postischemic rat brain[J].Jcereb Blood Flow Metab,1990,10：850－859.发表论文网站
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【关键词】 糖尿病；脑梗死；氦-氖激光；糖脑络通；cNOSmRNA
Effect of Intravenous Low Intensity Laser Radiation on cNOSmRNA in Experimentally Modeled Rabbit of Diabetic Stroke WANG Bo, WEI Hai-feng 1.The Second Hospital Attached to The General Hospital of PLA, Beijing 100091, China；2.Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Science, Beijing 100053, China Abstract：Objective To observe the effect of intravenous low intensity laser radiation (ILIB) with traditional chinese medicine on cNOSmRNA of the rabbits of experimental diabetic stroke. Method 35 successfully modeled rabbits, after alloxian injection for diabetes and photochemical radiation for stroke, were randomized into four treatment group：control group, ILIB group, traditional Chinese herb medicines treatment group, and a group with compound treatment of ILIB and TCH. 7 unmodeled rabbits were made as the normal group. The cNOSmRNA level was comparedwith eath other. Results Compared with control group, ILIB group and traditional Chinese herb medicines treatment group can’t significantly rectify the disorderly cNOSmRNA, but E can. Conclusions Group E can effectively reduce the cNOSmRNA level and nervous injury, cure diabetes cerebral infarction. Key words：diabetes mellitus；cerebral infarction；intravenous low intensity laser radiation；Traditional Chinese Medicine；cNOSmRNA 糖尿病患者血液多处于血流变高凝血状态[1-2],血管收缩状态有所改变。以往研究显示,低能量氦-氖激光血管内照射(ILIB)及活血化瘀中药能有效地改善患者及实验动物的血管收缩状态,提高一氧化氮(NO)水平。本实验拟通过观察ILIB及其配合中药治疗对实验性糖尿病脑梗死家兔神经元cNOSmRNA水平的影响,并比较它们的疗效。
1 材料及方法
1.1 仪器 ZJC480型电脑多功能氦-氖激光血管内照射治疗仪,长春中吉光电公司产品。JLT-B冷强光透照仪,河北泊头市医用光电仪器厂产品。1.2 造模 新西兰大白兔53只,购自中国药品生物制品检定所[北京市实验动物许可证,京动许字(2000)第017号总062号],体重2.5 kg左右,适应性喂养2周后,纳入实验。动物称重后随机抽出7只作为正常对照组,其余参考文献[3]造模。家兔禁食8～12 h,经耳缘静脉注射新鲜配制的5%四氧嘧啶生理盐水注射液,初次剂量为120 mg/kg,选取空腹血糖不足11.1 mmol/L者以150 mg/kg剂量注射。
选取经2次造模后空腹血糖在11.1 mmol/L以上者,每只每日给高脂饲料60 g(含1%胆固醇,15%蛋黄粉,5%猪油)加普通饲料喂养。2周后制作脑梗死模型。脑梗死模型：再参考文献[4-5]用光化学方法造成脑梗死。在以3%戊巴比妥钠1 mL/kg体重经耳缘静脉麻醉后,将其头部固定在立体定位仪上,取家兔左侧颅骨中线与冠状缝向后向左各0.6 cm处为中心,纵行切开头皮2 cm。暴露颅骨,用牙科车床锯开1 cm×1 cm大小的骨窗后,经耳缘静脉按1 mL/kg体重注射虎红(Rose Bengal, 3.5%),2 min后用冷强光透照仪经直径为0.7 cm的圆形光导探头由骨窗照射10 min。术区撒青霉素粉适量,局部以牙托粉封闭骨窗,逐层缝合切口。
1.3 分组及给药
将术后造模成功的家兔28只,以其血糖值随机分为模型组、单纯激光组、中药治疗组、激光+中药组各7只,进行以下处理。
发表论文网站
单纯激光组以3%戊巴比妥钠1 mL/kg体重经耳缘静脉麻醉后,经另侧耳缘静脉插入无菌一次性光纤针,经光纤导管连接低能量氦-氖激光血管内照射治疗仪。照射波长632.8 nm,输出功率3 mW。每次1 h,每2日1次,共治疗15次。中药治疗组予糖脑络通方煎剂(主要含黄芪、地黄、水蛭、丹参等)。所给药物均按人-兔等效剂量计算。激光+中药组在单纯激光组给药方法的基础上加用糖脑络通方煎剂。模型组同时灌胃相应体积的生理盐水。此后,各用药组每周测1次体重,根据体重调整给药量。
1.4 观察方法及检测指标
cNOSmRNA测定：cNOSmRNA探针由北京大学医学部病理系制作。取石蜡切片置60 ℃恒温培养箱30 min后浸入二甲苯,梯度乙醇水化,蛋白酶K消化,4%多聚甲醛固定,预杂交42 ℃、30 min(预杂交液：6×SSC,45%去离子甲酰胺,5×Denhardt's液,100 μg/mL变性鲑精DNA),加1 μg/mL变性探针的杂交液,42 ℃杂交20 h,然后分别用6×SSC-45 %去离子甲酰胺,2×SSC,缓冲液Ⅰ(100 mmol/L 马来酸,0.15 mol/L NaCl,pH7.5)和缓冲液Ⅱ(缓冲液Ⅰ 9 mL加封闭液1 mL)洗涤,滴加抗地高辛抗体,反应30 min后用NBT/BCIP显色6 h。显微镜下观察棕褐色阳性杂交信号,直接输入图像分析仪,定量测量各组每张切片。随机选15个海马阳性反应神经元,测定阳性细胞胞浆平均密度(OD),以反映染色程度,以任意单位(Arbitrary Unit)表示,进行比较[6]。
1.5 统计学方法
采用SPSS统计软件进行方差分析,LSD法进行组间比较。
2 结果
2.1 各组海马神经元阳性细胞胞浆平均密度比较
(见表1)表1 各组海马神经元阳性细胞胞浆平均密度(略)注：与正常组比较,★P<0.05；与模型组比较,ΔP<0.05；与单纯激光组比较,#P<0.05；与中药治疗组比较,●P<0.05。
2.2 治疗后各组cNOSmRNA原位杂交结果比较
正常组：海马神经元呈淡紫色,提示cNOSmRNA原位杂交弱阳性。模型组：海马神经元呈紫褐色染色,神经元排列尚整齐,提示cNOSmRNA原位杂交强阳性。单纯激光组：海马神经元呈紫褐色染色,神经元排列不甚整齐,提示cNOSmRNA原位杂交阳性,较模型组弱。中药治疗组：海马神经元排列整齐,cNOSmRNA原位杂交呈浅紫褐色染色,较模型组弱。激光+中药组：海马神经元呈淡紫色,神经元排列整齐,提示cNOSmRNA原位杂交弱性,但较正常组强。
3 讨论
星形胶质细胞胶原酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞的特异性标记物可用作鉴定星形胶质细胞。在各种刺激下,星形胶质细胞内GFAP表达的变化是一种表型的改变,可以反映细胞各种分子物质表达(包括蛋白质的合成)的改变及代谢的变化[7-8]。在体的星形胶质细胞GFAP表达的量及其形态特征还可因脑损伤,包括脑缺血等刺激而激活变为星形胶质细胞,可见细胞数目增多,其GFAP表达显著增高,并伴以细胞肥大[7-8]。星形胶质细胞内含有少量固定型(结构型)一氧化氮合酶(cNOS),缺血性脑损伤可诱发星形胶质细胞表达诱生型NOS(iNOS)。因星形胶质细胞在脑内数量巨大,故推测其表达iNOS而产生大量的NO,发挥神经毒性作用。发表论文网站
本实验结果显示,造模后cNOSmRNA在神经元的表达显著增加。中药+激光组可显著降低模型家兔神经元cNOSmRNA水平,减轻nNOS介导的神经损伤,而单纯激光组对cNOSmRNA在神经元的表达改善不明显。说明中药联合激光可以更好减轻nNOS介导的神经损伤,更有利于梗死后的神经功能恢复。
【参考文献】
[1] 曹丙振,樊 红,曲 伸,等.糖尿患者rCBF、血液流变学及血小板功能的研究[J].临床神经病学杂志,1994,7(2)：80－82.
[2] Rampling MW. Haemorheological disturbances in hypertension： the influence of diabetes and smoking[J]. Clin Hemorheol Microcirc 1999,21(3-4)：183－187.
[3] 孟庆棣.八仙长寿汤治疗糖尿病的实验研究[J].中成药研究,1984, (11)：25.
[4] Wester P, Watson BD, Prado R, et al. A photothrombotic ring model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion[J].Stroke,1995,26(3)：444－450.
[5] 石秉霞,徐建林,郭云良,等.光化学脑梗死动物模型建立的实验观察[J].青岛医学院学报,1995,31(2)：90－93.
[6] 徐庆中,段会玲,卢德宏,等.星形细胞瘤的胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白免疫组织化学定量研究[J].中华病理学杂志,1994,23(2)：66－68.
[7] Eddleston M, Mucke L.Molecular profiloe of reactive as–trocytes implications of their role in neurologic disease[J].Neurosci, 1993,34(5)：539－545.
[8] Petito CK, Morgello S, Felix LC, et al. The two patterns of reactive astrocytosis in postischemic rat brain[J].Jcereb Blood Flow Metab,1990,10：850－859.发表论文网站
