皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1mRNA表达及意义

【摘要】  目的： 检测活动期皮肌炎(dermatomyositis，DM)患者外周血CD4+T细胞中转化生长因子β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）以及血清磷酸肌酸激酶（CK）含量。初步探讨CD4+T细胞TGF?β1在皮肌炎发病机制中的作用。方法： 收集12例活动期皮肌炎患者和12例健康对照者外周血，采用免疫磁珠分离法获得CD4+T细胞，通过RT?PCR方法检测出各组TGF?β1表达水平。观察CD4+T细胞中TGF?β1表达与CK含量的相关性。结果： 活动期皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1相对表达量为0.751±0.107，显著高于健康对照0.438±0.170﹙P<0.05﹚。CD4+T细胞TGF?β1表达量与CK含量呈中度正相关﹙r=0.67, P<0.05﹚。结论： 活动性皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGF?β1 mRNA表达显著升高，可能与皮肌炎疾病发生有关。 中国论文发表

【关键词】  皮肌炎 CD4 T细胞 ?β1

    ［Abstract］  Objective: To investigate the expression of trans?forming growth factor?β1 (TGF?β1)mRNA in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis (DM)patients in active stage, and explore the association with serum creatinkinase levels. Methods： CD4+T cells from peripheral blood were isolated by microbeads，and TGF?β1 mRNA was measured by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT?PCR).  Results： The expression of TGF?β1 was significantly higher in CD4+ T cells from the dermatomyositis  patients than those from healthy control group (0.751±0.107 vs 0.438±0.170，P<0.05﹚. There was positive correlation between the expression levels of TGF?β1 mRNA and serum creatinkinase levels（r=0.67，P<0.05﹚. Conclusion： TGF?β1 was significantly higher in CD4+ T cells of peripheral blood from the dermatomyositis patients. TGF?β1 may play a role in the damage of DM.

    ［Key words］  dermatomyositis；CD4+ T cells；TGF?β1

    皮肌炎(dermatomyositis，DM)是一组亚急性或慢性起病、免疫介导的自身免疫性疾病, 主要表现为对称性的肢体近端无力、肌肉疼痛、肌酶明显升高，同时伴有以眶周为中心的紫红色水肿性斑、Gottron氏征等特征性皮肤损害。组织病理学特点为肌组织内炎细胞浸润与肌纤维坏死［1］。其病因及发病机制目前尚不完全清楚, 但近年来在皮肌炎患者受累皮肤和肌肉活检中发现大量活化的CD4+T细胞浸润，CD4+/CD8+比值为2.5［2］。转化生长因子β1（transforming growth factor?β1，TGF?β1）是人体多种组织细胞的生长调控因子，对细胞外间质表达、基质降解、细胞增殖分化和细胞凋亡功能等有明确的作用。并且，TGF?β1还具有较强的免疫调节作用。本研究通过检测皮肌炎患者外周血CD4+T细胞TGF?β1 mRNA的表达，同时与患者血清CK含量进行相关性分析,探讨其在皮肌炎发病机制中的作用。中国论文发表

    1  对象与方法

    1.1  研究对象　

    12例活动期皮肌炎患者选自2007年6月～2008年2月江苏大学附属医院风湿科、皮肤科门诊及住院患者，其中男5例，女7例，年龄40～65岁，平均51.6岁。病程2个月～3年，平均2.15年。诊断依据为1975年Bohan的诊断标准［3］,剔除合并肿瘤及重叠综合征患者。以临床表现、补体降低、肌酶、血沉升高以及肌电图改变综合判断疾病的活动性。检测前,患者至少3个月内未接受糖皮质激素、免疫抑制剂或具有免疫调节作用的药物治疗。选用单位体检正常者为健康对照组，其中男5例，女7例，年龄41～66岁，平均51.2岁。

    1.2  主要试剂与仪器

    Trizol试剂(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(Toyobo公司)；水平电泳槽(Bio?Rad公司)；凝胶电泳图像分析仪(Syngene公司)；免疫磁珠(Miltenyi公司)。

    1.3  细胞分离

    收集患者和健康对照者静脉血10 ml，肝素抗凝，通过淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，再采用免疫磁珠分离出CD4+T细胞，细胞纯度大于92%。

    1.4  RT?PCR

    按常规方法提取总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA后-20℃贮存备用。根据基因库中公布的基因序列，通过Primer Premier 5.0 软件设计PCR特异性引物，聚合酶链反应引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列为：β?actin上游引物5′?CACGAAACTACCTTCAACTCC3′，下游引物5′?CATACTCCTGCTTGCTGATC3′，扩增产物262 bp；TGF?β1上游引物5′?GCTCCTGTGACAGCAGGGAT3′，下游引物5′ ?GGCAGAAGTTGGCATGGTAG3′，扩增产物303 bp。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃（β?actin）或54℃（ TGF?β1 ）退火，72℃ 45 s，共30个循环，72℃延伸7 min。

    1.5  PCR产物分析及半定量计算

    PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，计算CD4+T细胞TGF?β1和β?actin条带密度比值（TGF?β1/β?actin）作为TGF?β1的相对表达强度。

    1.6  统计学分析

    所有数据采用SPSS11.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。两变量的相关程度采用直线相关分析法。中国论文发表

    2  结  果

    2.1  活动性皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1 mRNA表达水平检测结果

    健康对照（n=12）和皮肌炎患者（n=12）CD4+T细胞TGF?β1的相对表达强度分别为0.438±0.170和0.751±0.107，经检验t=5.38，P<0.01。见图1。

    2.2  活动期皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1 mRNA表达水平与血清CK含量相关性分析

    活动期皮肌炎患者CD4+T细胞与血清CK含量的相关系数为r=0.67，P<0.05，呈中度正相关。见图2。中国论文发表

    3  讨  论

    研究认为皮肌炎是由于日光辐射、微生物感染、外伤等诱因致使易感人群发生自身免疫紊乱并导致皮肤、横纹肌为主等器官损伤的一种结缔组织疾病。皮肌炎患者肌内膜及其血管周围存在大量以活化的CD4+T淋巴细胞为主，部分B细胞以及巨噬细胞参与的单个核细胞群的浸润［4］。近来研究发现皮损组织中Th淋巴细胞介导的炎症，微血管损害和角质形成细胞的凋亡失调是疾病发生的重要机制。

    TGF?β1是一类具有双向调节功能的生长因子，主要由活化的T细胞、B细胞和巨噬细胞合成和分泌，某些肿瘤细胞、成骨细胞以及内皮细胞也可产生，TGF?β1能趋化巨噬细胞和成纤维细胞，促进血管生成，从而在创伤修复中起重要作用。TGF?β1也具有促进和抑制免疫的双向调节功能。根据不同的表达量发挥不同的效应。对TGF?β1基因敲除小鼠的研究发现［5］，肌肉组织中TGF?β1在正常表达情况下具有抗炎作用。然而当TGF?β1过度表达时，促进炎症发生并可导致肌内膜纤维化。此作用可能与TGF?β1刺激自身肌肉组织结缔组织生长因子的表达有关。CTGF能促进成纤维细胞增殖迁移, 细胞外基质形成［6］。在Duchenne 肌营养不良病中发现肌组织中TGF?β1 mRNA表达明显增高。Amemiya等［7］对5例皮肌炎患者采用大剂量静脉滴注免疫球蛋白治疗，对治疗前后患者肌活检比较后发现，临床症状和组织学改善的同时TGF?β1表达也显著下降。

    本次实验结果显示，皮肌炎患者CD4+T细胞TGF?β1表达明显高于健康对照组。皮肌炎患者血清CK均值为（2503.42±1344.05）U/L，较正常值（0～200 U/L）显著增高，与TGF?β1表达呈中度正相关。提示TGF?β1可能是导致皮肌炎肌肉损害的原因之一。患者中有5例伴有肺间质病变，肺纤维化，1例伴甲状腺瘤，1例伴甲状腺功能减退；5例肺间质病变、肺纤维化患者TGF?β1表达尤为增高，均高于0.80；可能与TGF?β1具促进成纤维细胞增殖致纤维化有关。此外，TGF?β1还对早期肿瘤有抑制作用，进展期促进肿瘤浸润、转移［8］。皮肌炎患者特别是部分老年患者常伴随肿瘤的发生。本次实验中并未发现伴有肿瘤的患者，可能与所选病例病程较短以及样本数量少、患者以中年为主有关。要进一步了解TGF?β1在皮肌炎发病机制中的作用还需要增加病例作进一步研究。中国论文发表

【参考文献】
  ［1］ 史玉泉, 周孝达, 吕传真. 实用神经病学［M］.3 版.上海: 上海科学技术出版社, 2004：1271-1273.

［2］ Caproni M, Torchia D，Cardinali C，et al.Infiltrating cells,related cytokines and chemokine receptors in lesional skin of patients with dermatomyositis［J］. Br J Dermatol，2004,151(4):784-791.

［3］ Smits HH, de Jong EC, Schuitemaker JH, et al. Intercellular adhesion molecule?1/LFA?1 ligation favors human Th1 development ［J］. J Immunol，2002 ,168(4):1710-1716.

［4］ Grundtman C, Malmstrom V, Lundberg IE. Immune mechanisms in the pathogenesis of idiopathic inflammatory myopathies［J］. Arthritis Res Ther，2007,9(2): 208.

［5］ Amemiya K,Semino?Mora C,Granger R,et al.Development of inflammatory myopathy in TGF?β1 knockout mice: Characterization of the disease and attenuation after treatment with fibronectin peptides［J］. Neurology，1999,52(S2)：A448.

［6］ Maeda N, Kanda F, Okuda S, et al. Transforming growth factor?beta enhances connective tissue growth factorexpression in L6 rat skeletal myotubes［J］. Neuromuscul Disord，2005，15(11)：790-793.

［7］ Amemiya K, Semino?Mora C, Granger RP, et al.Downregulation of TGF?beta1 mRNA and protein in the muscles of patients with inflammatory myopathies after treatment with high?dose intravenous inmmunoglobulin［J］.Clin Immunol ,2000 ,94(2):99-104.

［8］ 俞清翔.转化生长因子β与肿瘤转移的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2006，14（25）:2538-2541.中国论文发表