他莫昔芬对雌激素干预后血管性痴呆大鼠海马CA1区GFAP表达的影响
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时间：2012年3月21日 14:25
血管性痴呆(Vascular Dementia,简称VD) : 血管性痴呆是指因脑血管疾病所致的智能及认知功能障碍临床综合征。有资料显示我国AD 与VD 的比率大致相同[1]。由于VD的生活能力下降,严重威胁着老年人的健康和生存质量,给家庭和社会造成了巨大负担。近年来研究证实,雌激素对中枢神经系统损伤后有保护作用且能改善记忆和认知功能[2]，但其作用机制还不十分清楚。
目前雌激素对星形胶质细胞影响的报道较少，本实验旨在探讨他莫昔芬作用于雌激素干预后VD大鼠后海马CA1区GFAP表达的影响,以期进一步揭示雌激素的脑保护作用机制,为应用雌激素防治血管性痴呆提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Y型电迷宫（江苏省张家港市生物医学仪器厂），德国Lecia图像采集系统，图像分析软件Biosens Digital Imaging System上海山富科学仪器有限公司；17β-雌二醇（美国Sigma 公司）；他莫昔芬（武汉远城科技发展有限公司）；SP免疫组化染色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；兔抗GFAP多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）。
1.2 动物与分组
健康雄性Wistar大鼠,5～6月龄,体重250～280克,（河南省医学动物实验中心提供）,以Y型电迷宫筛选记忆良好的大鼠30只，随机分成他莫昔芬组，实验对照组, 雌二醇治疗组。每组均为10只。
1.3 给药方法
雌二醇治疗组于术后第2天起予以腹腔注射给17β-雌二醇200μg/kg（花生油溶解），隔天1次；他莫昔芬组给予他莫昔芬(3 mg/kg)每日喂服60天，于术后第2天起予以腹腔注射给17β-雌二醇200μg/kg（花生油溶解），隔天1次；实验对照组给予等量消毒过的花生油, 隔天1次，连续给药30次。
1.4 动物模型制作
参照Ni等[3]方法制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12h禁食, 4h禁水, 10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定,颈前部去毛消毒后正中切开,分离双侧颈总动脉,双重丝线结扎,间断缝合皮肤。术后动物送到通风的动物房饲养。
1.5 大鼠学习记忆能力测试
采用Y型电迷宫法,于模型制作60d后在三等分Y型电迷宫内进行大鼠学习能力测试。先将大鼠放入迷宫内适应5min，使其对三臂均探索进入，然后从起步区臂出发，开始以随机次序变换测试。设定电压50V，延迟时间4S：电击后大鼠直接逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应，每测1次休息30 S，测l0次休息5min。大鼠学习成绩以连续30次电击测试中正确反应次数表示。每次测试均放在安静的、光线稍暗的条件下进行。记忆能力测试以24h后大鼠再次测试30次,记录正确反应次数表示。
1.6 HE染色免疫组化染色
常规灌注取脑，切取视交叉到小脑前的冠状位切片，经4%多聚甲醛溶液后固定24h，常规脱水石蜡包埋，作4～6μm厚的切片，HE染色。免疫组化染色采用SP（兔抗GFAP 1:80）法常规染色。
2 统计方法
在海马CA1区,每张片子分别选择5个相邻视野,在400倍光镜下随机计数GFAP免疫阳性细胞数,结果取5个视野的平均值。并经过统计软件SPSS10.0做单因素方差分析处理，对3组结果进行比较，取P<0.05为差异显著性。
3 结果
3.1 大鼠Y型电迷宫实验结果
17β-雌二醇治疗组与实验对照组及他莫昔芬组相比能明显提高学习成绩和记忆成绩（p<0.05）,见表1。
表 1 5组大鼠学习和记忆成绩(MEAN±SD)
组别 只数（n） 学习成绩 记忆成绩
他莫昔芬组 10 11.80±3.43* 16.20±1.87*
实验对照组 10 10.10±2.77* 16.00±1.94*
雌二醇治疗组 10 19.70±2.75 21.60±2.46
* 表示用单因素方差分析与雌二醇治疗组相比，有显著性差异（P<0.05)。
3.2 HE染色光镜下病理形态学改变
①他莫昔芬组与实验对照组神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱，胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆周围发现空晕，胞间距较大，并可见大量不规则形胶质细胞及散在胶质细胞增生小结，仅见少量正常神经细胞。②雌二醇治疗组偶见小的软化灶，正常神经细胞数目较多，排列较密，胞核圆或椭圆形，核仁清晰，染色质丰富，少见固缩变性的神经元。
3.3 GFAP免疫组化结果
3.3.1 各组大鼠海马CA1区内GFAP阳性细胞形态的变化
他莫昔芬组与实验对照组GFAP阳性细胞的胞体肿胀、肥大，突起增粗、变长现象明显，分支减少，GFAP表达明显增强，数目明显增多；雌二醇治疗组GFAP阳性细胞数目较少，胞体较小，突起较少、短，GFAP表达较弱，染色较淡。 (见图1、图2、图3)
3.3.2 GFAP阳性细胞计数统计结果(MEAN±SD)
他莫昔芬组与实验对照组的GFAP阳性细胞数明显增多，与雌二醇治疗组比较有显著性差异（P<0.05）；雌二醇治疗组与实验对照组比较，阳性细胞数明显减少（P<0.05）。见表2
表 2 GFAP阳性细胞计数统计结果
组别 只数 GFAP阳性细胞数
他莫昔芬组 10 28.08±2.77*
实验对照组 10 28.80±1.64*
雌二醇治疗组 10 20.36±2.51
* 表示用单因素方差分析与雌二醇治疗组相比，有显著性差异（P<0.05)。
4 讨论
本实验模拟人类血管粥样硬化所致的头颈动脉逐渐狭窄而引起的慢性脑供血不足，本组实验结果表明雌二醇组能够明显提高慢性缺血后大鼠的学习和记忆能力，改善认知功能，而且这种作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断。海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分，在学习和记忆等高级神经活动中起关键作用，海马缺血性损害可能是VD的重要病理基础之一。本研究中病理学检查结果证实雌二醇能减少海马神经元的缺血坏死，减轻脑组织的不可逆损害，这与近年来国内外学者研究的结果相一致 [4-6]。并且雌激素受体拮抗剂可阻断雌激素的脑保护作用,一定程度上证实了雌激素可能通过与受体相结合,提高其与特定靶基因相结合的能力,从而诱导或抑制靶细胞特异基因的转录，而这一作用比较缓慢和持久。 在脑缺血或脑损伤过程中，常常伴有星形胶质细胞的活化增生，大量的星形胶质细胞增生，又会影响神经纤维的传导和突触的构建[7-8]。GFAP是星形胶质细胞合成的重要骨架蛋白，是星形胶质细胞中主要的中间丝蛋白，是星形胶质细胞的特征性标志，GFAP免疫反应增强表明星形胶质细胞被活化。本实验结果显示，与雌二醇治疗组相比，他莫昔芬组与实验对照组海马区GFAP阳性神经元数量明显增加，且这种增加的程度和学习记忆能力的减退呈相关关系。雌性激素治疗60d后，雌激素治疗组与实验对照组相比能降低海马CA1区的GFAP免疫阳性细胞的表达。而且这种保护作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断。
综上所述，雌二醇补充治疗可改善脑缺血后大鼠神经功能评分，下调海马CA1区GFAP的表达，减轻脑缺血后脑组织的损伤，具有确切的神经保护作用。而且这种保护作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断，这些研究为将来开发雌激素应用于临床治疗VD提供理论证据。
参 考 文 献
[1] Wang W. Prevalence of Alzheimer’s disease and other dementing disorders in an urban community of Beijing. Neuroepidemilolgy 2000;19(4) :194.
[2] Granholm AC, Ford KA, Hyde LA, et al. Estrogen restores cognition and cholinergic phenotype in an animal model of Down syndrome. Physiol Behav, 2002, 77 (223) : 371.
[3] Ni J ,Ohta H, Matsumoto K, et al. Progressive cognive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral caritid arteries in rats. Brain Res, 1994, 653 (122) : 231.
[4] 李露斯，王兴华，范文辉．雌二醇对慢性脑缺血去卵巢大鼠脑病理改变的影响．第三军医大学学报，2002,24:l39l-1393.
[5] KondoY, Suzuki k, Sakuma Y.Estrogen alleviates cognitive dysfunction following transient brain ischemia in ovariectomized gerbils.Neurosci Lett．1997 238：45-48.
[6] Toung TJ，Traystman RJ.Hum PD．Estrogen—mediated neuroprotection after experimental stroke in male rats.Stroke，1998．29：1666—1670.
[7] Ridet JL,Malhotra SK,Privat A,et al.Reactive astrocytes:cellular and molecular cues to biological function [J].Trends Neurosci,1997,20:570-577.
[8] Liesi P,Kauppila T. Induction of type IV collagen and other basement membrane associated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar [J].Exp Neurol,2002,173:31-45.
目前雌激素对星形胶质细胞影响的报道较少，本实验旨在探讨他莫昔芬作用于雌激素干预后VD大鼠后海马CA1区GFAP表达的影响,以期进一步揭示雌激素的脑保护作用机制,为应用雌激素防治血管性痴呆提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Y型电迷宫（江苏省张家港市生物医学仪器厂），德国Lecia图像采集系统，图像分析软件Biosens Digital Imaging System上海山富科学仪器有限公司；17β-雌二醇（美国Sigma 公司）；他莫昔芬（武汉远城科技发展有限公司）；SP免疫组化染色试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；兔抗GFAP多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）。
1.2 动物与分组
健康雄性Wistar大鼠,5～6月龄,体重250～280克,（河南省医学动物实验中心提供）,以Y型电迷宫筛选记忆良好的大鼠30只，随机分成他莫昔芬组，实验对照组, 雌二醇治疗组。每组均为10只。
1.3 给药方法
雌二醇治疗组于术后第2天起予以腹腔注射给17β-雌二醇200μg/kg（花生油溶解），隔天1次；他莫昔芬组给予他莫昔芬(3 mg/kg)每日喂服60天，于术后第2天起予以腹腔注射给17β-雌二醇200μg/kg（花生油溶解），隔天1次；实验对照组给予等量消毒过的花生油, 隔天1次，连续给药30次。
1.4 动物模型制作
参照Ni等[3]方法制作慢性脑灌注不足动物模型。大鼠术前12h禁食, 4h禁水, 10%水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉,保证手术期间有自主呼吸。仰卧固定,颈前部去毛消毒后正中切开,分离双侧颈总动脉,双重丝线结扎,间断缝合皮肤。术后动物送到通风的动物房饲养。
1.5 大鼠学习记忆能力测试
采用Y型电迷宫法,于模型制作60d后在三等分Y型电迷宫内进行大鼠学习能力测试。先将大鼠放入迷宫内适应5min，使其对三臂均探索进入，然后从起步区臂出发，开始以随机次序变换测试。设定电压50V，延迟时间4S：电击后大鼠直接逃避至安全区为正确反应，否则为错误反应，每测1次休息30 S，测l0次休息5min。大鼠学习成绩以连续30次电击测试中正确反应次数表示。每次测试均放在安静的、光线稍暗的条件下进行。记忆能力测试以24h后大鼠再次测试30次,记录正确反应次数表示。
1.6 HE染色免疫组化染色
常规灌注取脑，切取视交叉到小脑前的冠状位切片，经4%多聚甲醛溶液后固定24h，常规脱水石蜡包埋，作4～6μm厚的切片，HE染色。免疫组化染色采用SP（兔抗GFAP 1:80）法常规染色。
2 统计方法
在海马CA1区,每张片子分别选择5个相邻视野,在400倍光镜下随机计数GFAP免疫阳性细胞数,结果取5个视野的平均值。并经过统计软件SPSS10.0做单因素方差分析处理，对3组结果进行比较，取P<0.05为差异显著性。
3 结果
3.1 大鼠Y型电迷宫实验结果
17β-雌二醇治疗组与实验对照组及他莫昔芬组相比能明显提高学习成绩和记忆成绩（p<0.05）,见表1。
表 1 5组大鼠学习和记忆成绩(MEAN±SD)
组别 只数（n） 学习成绩 记忆成绩
他莫昔芬组 10 11.80±3.43* 16.20±1.87*
实验对照组 10 10.10±2.77* 16.00±1.94*
雌二醇治疗组 10 19.70±2.75 21.60±2.46
* 表示用单因素方差分析与雌二醇治疗组相比，有显著性差异（P<0.05)。
3.2 HE染色光镜下病理形态学改变
①他莫昔芬组与实验对照组神经细胞结构松散、数目减少、排列紊乱，胞核深染、固缩，核仁消失，胞浆周围发现空晕，胞间距较大，并可见大量不规则形胶质细胞及散在胶质细胞增生小结，仅见少量正常神经细胞。②雌二醇治疗组偶见小的软化灶，正常神经细胞数目较多，排列较密，胞核圆或椭圆形，核仁清晰，染色质丰富，少见固缩变性的神经元。
3.3 GFAP免疫组化结果
3.3.1 各组大鼠海马CA1区内GFAP阳性细胞形态的变化
他莫昔芬组与实验对照组GFAP阳性细胞的胞体肿胀、肥大，突起增粗、变长现象明显，分支减少，GFAP表达明显增强，数目明显增多；雌二醇治疗组GFAP阳性细胞数目较少，胞体较小，突起较少、短，GFAP表达较弱，染色较淡。 (见图1、图2、图3)
3.3.2 GFAP阳性细胞计数统计结果(MEAN±SD)
他莫昔芬组与实验对照组的GFAP阳性细胞数明显增多，与雌二醇治疗组比较有显著性差异（P<0.05）；雌二醇治疗组与实验对照组比较，阳性细胞数明显减少（P<0.05）。见表2
表 2 GFAP阳性细胞计数统计结果
组别 只数 GFAP阳性细胞数
他莫昔芬组 10 28.08±2.77*
实验对照组 10 28.80±1.64*
雌二醇治疗组 10 20.36±2.51
* 表示用单因素方差分析与雌二醇治疗组相比，有显著性差异（P<0.05)。
4 讨论
本实验模拟人类血管粥样硬化所致的头颈动脉逐渐狭窄而引起的慢性脑供血不足，本组实验结果表明雌二醇组能够明显提高慢性缺血后大鼠的学习和记忆能力，改善认知功能，而且这种作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断。海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分，在学习和记忆等高级神经活动中起关键作用，海马缺血性损害可能是VD的重要病理基础之一。本研究中病理学检查结果证实雌二醇能减少海马神经元的缺血坏死，减轻脑组织的不可逆损害，这与近年来国内外学者研究的结果相一致 [4-6]。并且雌激素受体拮抗剂可阻断雌激素的脑保护作用,一定程度上证实了雌激素可能通过与受体相结合,提高其与特定靶基因相结合的能力,从而诱导或抑制靶细胞特异基因的转录，而这一作用比较缓慢和持久。 在脑缺血或脑损伤过程中，常常伴有星形胶质细胞的活化增生，大量的星形胶质细胞增生，又会影响神经纤维的传导和突触的构建[7-8]。GFAP是星形胶质细胞合成的重要骨架蛋白，是星形胶质细胞中主要的中间丝蛋白，是星形胶质细胞的特征性标志，GFAP免疫反应增强表明星形胶质细胞被活化。本实验结果显示，与雌二醇治疗组相比，他莫昔芬组与实验对照组海马区GFAP阳性神经元数量明显增加，且这种增加的程度和学习记忆能力的减退呈相关关系。雌性激素治疗60d后，雌激素治疗组与实验对照组相比能降低海马CA1区的GFAP免疫阳性细胞的表达。而且这种保护作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断。
综上所述，雌二醇补充治疗可改善脑缺血后大鼠神经功能评分，下调海马CA1区GFAP的表达，减轻脑缺血后脑组织的损伤，具有确切的神经保护作用。而且这种保护作用可被雌激素受体拮抗剂所阻断，这些研究为将来开发雌激素应用于临床治疗VD提供理论证据。
参 考 文 献
[1] Wang W. Prevalence of Alzheimer’s disease and other dementing disorders in an urban community of Beijing. Neuroepidemilolgy 2000;19(4) :194.
[2] Granholm AC, Ford KA, Hyde LA, et al. Estrogen restores cognition and cholinergic phenotype in an animal model of Down syndrome. Physiol Behav, 2002, 77 (223) : 371.
[3] Ni J ,Ohta H, Matsumoto K, et al. Progressive cognive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral caritid arteries in rats. Brain Res, 1994, 653 (122) : 231.
[4] 李露斯，王兴华，范文辉．雌二醇对慢性脑缺血去卵巢大鼠脑病理改变的影响．第三军医大学学报，2002,24:l39l-1393.
[5] KondoY, Suzuki k, Sakuma Y.Estrogen alleviates cognitive dysfunction following transient brain ischemia in ovariectomized gerbils.Neurosci Lett．1997 238：45-48.
[6] Toung TJ，Traystman RJ.Hum PD．Estrogen—mediated neuroprotection after experimental stroke in male rats.Stroke，1998．29：1666—1670.
[7] Ridet JL,Malhotra SK,Privat A,et al.Reactive astrocytes:cellular and molecular cues to biological function [J].Trends Neurosci,1997,20:570-577.
[8] Liesi P,Kauppila T. Induction of type IV collagen and other basement membrane associated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar [J].Exp Neurol,2002,173:31-45.
