β?葡聚糖对巨噬细胞增殖 胞内游离钙及cAMP浓度的影响

【摘要】  探讨β?葡聚糖对RAW264.7细胞增生、胞内游离钙及cAMP浓度的影响。方法： 中性红比色法检测细胞生长, 酚试剂法检测细胞蛋白质合成, 动态检测β?葡聚糖对胞内游离钙和cAMP浓度的影响。结果： 微量β?葡聚糖可促进细胞生长及蛋白质合成;β?葡聚糖作用后3～5 min使胞内游离钙浓度升高,作用1 min 后使cAMP浓度升高, 并保持较高水平。结论： 胞内游离钙及cAMP是β?葡聚糖对RAW264.7细胞作用过程中重要的信使分子。 医学职称论文发表

【关键词】  β?葡聚糖 胞内游离钙 环磷酸腺苷 RAW264.7细胞系 增殖

    ［Abstract］  Objective: To explore the effect of β?glucan on proliferation, intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay, protein synthesis by Lowry′s test, and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by β?glucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 3～5 min after treatment with β?glucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintained at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of β?glucan on RAW264.7 cell line.

    ［Key words］  β?glucan;  intracellular calcium;  cAMP; RAW264.7 cell line;  proliferation

    随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的大量应用,器官移植技术的广泛开展、各种导管的广泛应用及肿瘤治疗的广泛应用,真菌感染尤其深部真菌性医院感染日益增多。 β?葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为观察对象，观察不同浓度及不同时间的β?葡聚糖对RAW264.7细胞的直接影响, 特别是对细胞内第二信使传递的影响, 以探讨β?葡聚糖对RAW264.7细胞的作用机制。医学职称论文发表

    1  材料与方法

    1.1  试  剂

    RPMI1640、胎牛血清购自Gibco公司；Fura?2 AM 购自中国科学院药物所；β?葡聚糖和EGTA购自Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

    1.2  细胞培养

    小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。于37℃，5%CO2湿润环境中培养, 每3天更换1次培养液, 细胞生长汇合成单层细胞时及时传代, 常规培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。

    1.3  细胞生长曲线和蛋白质含量的测定

    取对数生长期的细胞按3×103 个/孔接种于96孔板(Cellstar),共接种16板。待细胞贴壁后，吸出孔内的培养液和未贴壁的细胞。各给药组分别给予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml  β?葡聚糖的培养液200  μl，进行培养。每板上作对照,每个β?葡聚糖浓度作3个平行孔。每天定时取上述培养板2块, 于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况, 然后将其中1块板以中性红比色法［1］检测细胞生长情况,另1板用lowry法测定蛋白质含量［2］。以培养时间(d)为横坐标, 中性红比色法测得的D值和蛋白质含量为纵坐标, 分别绘制细胞生长曲线和蛋白质变化曲线。

    1.4  胞内游离钙浓度测定　

    细胞内游离钙浓度的测定按文献［3］方法进行。

    1.5  cAMP浓度测定　

    于100 ml培养瓶内接种RAW264.7细胞, 待细胞生长接近汇合时给予不同浓度β?葡聚糖刺激, 分别于刺激后1，5和15 min 3个时间点取样。取样时弃培养液, 立即向瓶内加入1 ml 预冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液, 用橡皮刮收集细胞,冰浴下超声破碎细胞, 离心取上清, 以KOH中和至pH 6.3左右, 去除沉淀的高氯酸钾, 取上清液冷冻干燥后于-20℃保存备用。cAMP浓度测定按试剂盒(上海中医药大学)说明书进行。医学职称论文发表

    1.6  数据处理　

    实验结果用±s表示, 以方差分析作统计学处理。

    2  结  果

    2.1  β?葡聚糖对RAW264.7细胞生长的影响

    在相差显微镜下观察, β?葡聚糖对RAW264.7细胞形态无明显影响。对生长曲线和培养液内蛋白质含量的作用均呈双相性(图1，图2)。低浓度β?葡聚糖对RAW264.7细胞具有促进作用, 随着β?葡聚糖浓度的逐渐增大, D值也不断升高, 至β?葡聚糖浓度100 μg/ml时达最高峰, 与对照组(不加β?葡聚糖)比较差异有统计学意义(P<0.01), 但β?葡聚糖浓度进一步增高, D值反而下降, 当浓度为400 μg/ml时几乎完全抑制细胞增殖。

    2.2  β?葡聚糖对RAW264.7细胞游离钙的影响

    加入β?葡聚糖刺激后胞内游离钙迅速上升, 在5 min时反应达高峰, 游离钙上升幅度与β?葡聚糖浓度有关(图3)。以EGTA螯合培养环境中钙离子的结果显示，细胞外钙离子存在与否对β?葡聚糖刺激引起的细胞游离钙波动有明显影响(图4)。提示升高的游离钙来自细胞外Ca2+的内流。

    2.3  β?葡聚糖对RAW264.7细胞内cAMP含量的影响

    β?葡聚糖刺激1 min时细胞内cAMP明显增高(P<0.01), 刺激后5～10 min 则cAMP含量开始下降,但仍较基础水平高(图5)。医学职称论文发表

    3  讨  论

    巨噬细胞是机体免疫系统专职吞噬细胞之一,源自血液单核细胞,广泛分布于所有组织中,成为机体抗入侵微生物的第一道防线,在机体抗真菌感染中也起着重要作用。它通过免疫球蛋白受体和补体受体识别并吞噬受调理素作用的微生物;对于未经调理作用的微生物,则通过一组胚系编码的蛋白-模式识别受体(PRRs)［4］迅速识别表达于微生物表面的称作病原相关微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子,如主要存在于革兰阴性菌的脂多糖、革兰阳性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等［5］ 。β?葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖, 具有广泛的生物学效用。已有研究表明, β?葡聚糖可促进多种细胞活化［6］。我们注意到微量β?葡聚糖虽可促进RAW264.7细胞增生, 但对细胞结构形态无明显作用。通过对细胞内第二信使传递系统的观察发现,β?葡聚糖可明显增加细胞内游离钙和cAMP。胞内游离钙和cAMP是细胞内重要的信使分子, 介导许多重要的生理功能。通过观察细胞游离钙和cAMP的变化, 可以了解β?葡聚糖信号在靶细胞内的传导机制。

    本实验结果表明,β?葡聚糖刺激可在2～5 min内使细胞内游离钙迅速升高, 而且在一定范围内其上升幅度与β?葡聚糖剂量相关。细胞外Ca2+存在与否对β?葡聚糖刺激后胞内游离钙波动有明显影响, 提示胞内游离钙的升高主要来源于细胞外Ca2+的内流而非细胞内钙库的动员。β?葡聚糖使细胞内cAMP浓度升高是否与β?葡聚糖促细胞增生作用有关, 尚有待进一步研究, 但我们的实验结果提示, cAMP含量变化与细胞蛋白合成的量相关。医学职称论文发表

【参考文献】
  ［1］ 闻 平, 何 艳, 叶庆林, 等.中性红比色法检测细胞增殖活性［J］.镇江医学院学报, 2000, 10 (1): 161-163.

［2］ Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent ［J］.J Biol Chem, 1951,193(1): 265-275.

［3］ Ye QL,Wagner M，Smythe S，et al.Thyrotrophin, but not forskolin, increases intracellular free calcium and calmodulin in pig thyroid cells［J］.J Endocrinol, 1991, 129(2): 291-299.

［4］ Diniz SN, Nomizo R, Cisalpino PS, et al.PTX3 function as an opsonin for the dectin?1?dependent internalization of zymosan by macrophages［J］.J Leukoc Biol, 2004, 75 (4): 649-656.

［5］ Janeway CA Jr, Medzhitov R.Innate immune recognition ［J］.Annu Rev Immunol，2002,20:197-216.

［6］ Brown GD, Gordon S.Fungal beta?glucans and mammalian immunity［J］.Immunity,2003,19(3):311-315.医学职称论文发表