中药中皂苷类化合物的抗氧化活性评价研究

【摘要】  目的以人参、西洋参、三七中的皂苷类化合物为研究对象研究其抗氧化性能。方法采用Photochemi-luminescence (PCL)抗氧化活性体外评价体系为分析平台系统考察皂苷类化合物的抗氧化活性，并利用DPPH法进行对照评价。结果人参、西洋参和三七95%乙醇提取的皂苷类化合物均具有一定的清除自由基活性，并且随着皂苷含量的增加，其清除自由基能力增强。结论PCL法成功应用于皂苷类化合物的清除自由基能力研究。

【关键词】  人参； 西洋参； 三七； 皂苷类化合物； 抗氧化活性

　　Abstract：ObjectiveTo explore the antioxidative activity of the saponins in Panax ginseng, Panax quinquefoljus and Panax notoginseng.  MethodsPhotochemi-luminescence (PCL) was applied to determine the antioxidative activity of the saponins for the first time, and DPPH method was developed for evaluating the scavenging activity of the extracts.Photochemi-luminescence (PCL) was applied to determine the antioxidative activity of the saponins for the first time, and DPPH method was developed for evaluating the scavenging activity of the extracts.ResultsThe saponins of 95% ethanol extracts from Panax ginseng, Panax quinquefoljus, Panax notoginseng had obvious anti-radical capacity, the efficiency inereased with the contents of major saponins extracted from plants.ConclusionPCL method is successfully applied to study the the antioxidative activity of the saponins. 

　　Key words： Panax ginseng;   Panax quinquefoljus;  Panax notoginseng;   Saponins;   Antioxidant
    
　　现代研究发现很多疾病的发生与自由基反应有关。活性氧自由基可直接或间接损伤DNA，导致DNA链断裂和染色体断裂［1］。因此，研究清除氧自由基的物质是生命科学发展的必然趋势［2～4］。传统中药在缓解衰老以及衰老性疾病的防治方面有着极为丰富的实践经验，我国中草药资源丰富，因此从中草药中寻找低毒高效的抗氧化剂是一个很好的途径。人参是具有极高药用价值的传统中药，在中医治疗中常用于大补元气、调补五脏及延缓衰老，是一种重要的抗衰老药物，人参以及和它亲缘关系较近的西洋参、三七的抗氧化作用已经被应用到食品和化妆品等领域。
    
　　人参Panax ginseng C.A.Mey.、西洋参Panax quinquefoljus L.、三七Panax notoginseng（Burk）F.H.chen系五加科人参属中重要的3种植物，是我国名贵中药材。三者主要的有效成分均为皂苷类化合物，已有的研究表明，人参皂苷具有多种生理活性［5］，几乎可作用于人体的各个生命系统［6，7］。研究发现人参皂苷类化合物具有清除自由基的作用［8，9］，但是在自由基清除剂方面人参皂苷是一种较弱的自由基清除剂，此特性在联合用药中有利于人参皂苷抗自由基作用的缓慢释放。近年研究中清除自由基的实验多采用Fenton、Haber-Weiss、DPPH法等紫外分光光度计法进行分析［10，11］，本研究将光化学发光(PCL-photochemi-luminescence)法应用于皂苷类化合物的清除自由基能力分析。
    
　　光化学发光(PCL)法是一种测定抗氧化剂和自由基的方法，其样品制备简单，分析时间短，试剂用量较少，不受温度和pH值的影响，且由光化学法生成自由基，简单、快捷、可靠；并采用化学发光法检测自由基，保证了极高的灵敏度。此法已成功测定了维生素片剂的水溶性抗氧化能力［12］，此外这种方法在国内的应用报道还比较少。
    
　　采用不同体外抗氧化实验体系测定样品时，由于抗氧化作用机制不同，有可能产生的结果也不一致，所以一般要求至少采用两种方法来衡量样品的抗氧化活性［13］。本实验以人参、西洋参、三七中的皂苷类化合物为研究对象，采用Photochemi-luminescence (PCL)抗氧化活性体外评价体系为分析平台，系统考察皂苷类化合物的抗氧化活性，并利用DPPH法进行对照评价，为应用一种较新的体外抗氧化活性的方法提供实验数据。

　　1  材料与仪器
    
　　实验所用液相试剂均为色谱纯试剂（Caledon LaboratoriesL Ltd公司，加拿大），0.45 μm滤膜（安捷伦公司，美国），其它试剂为分析纯 （北京化工厂），用于PCL 分析的溶剂由AnalytikJena AG公司 （德国）提供。二苯基苦基苯肼自由基 （1，1 -diphenyl- 2 - p icryhydrazyl， DPPH·）购于Sigma公司（美国）。人参切片、西洋参切片、三七根部药材均购于北京同仁堂大药房（长春分店），人参皂苷Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rc，Rd和三七皂苷 R1对照品购于中国药品生物制品检定所。Agilent-1100高效液相色谱(安捷伦公司，美国)；DU800紫外可见分光光度计(Backman公司，美国)；旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；S180H超声清洗器(Elma 公司，德国)；BS 124S电子天平( Sartorius AG，德国)；耶拿Photochem抗氧化剂与自由基分析仪（AnalytikJena AG 公司，德国）。

　　2  方法

　　2.1  样品溶液的制备分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末 (0.15 mm粒径) 1.006 3 ，1.004 7 ，1.002 7 g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)超声提取 30 min，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩至干，残渣用甲醇溶解过 0.45 μm滤膜，定容于10    ml容量瓶中，制得人参、西洋参和三七样品溶液。
    
　　分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末 (0.15 mm粒径) 1.005 6 g、1.004 8 g和1.006 9 g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)回流提取2 h，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩至干，残渣用甲醇溶解过 0 . 45 μm滤膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人参、西洋参和三七样品溶液。
    
　　分别精密称取人参、西洋参、三七药材粉末 (0.15 mm粒径) 1.007 8 g 1.0063 g和1.006 0g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)60℃水浴温浸提取 2 h，提取3次。将乙醇提取液过滤，减压回收乙醇，浓缩至干，残渣用甲醇溶解过 0.45 μm滤膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人参、西洋参和三七样品溶液。

　　2.2  高效液相色谱条件采用美国Agilent1100系统，DAD二极管阵列检测器。Agilent 1100 Series自动进样器；Agilent-C18 色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm) (美国安捷伦)，柱温 35℃。采用二元线性梯度洗脱，流速为0.5 ml /min，流动相组成为乙腈（A），0.05%的磷酸水溶液（B），样品分析时间为50 min，样品进样量为10 μl，检测波长为203 nm。流动相梯度：0～2 min，75%～75%B；2～50 min，75%～50% B。

　　2.3  抗氧化活性的PCL法分析采用Photochem@ (Berlin, Germany)超快速抗氧化剂和自由基全自动分析仪，测定原理是由光化学法生成自由基，并利用化学发光法检测自由基。发光氨(Luminol)是一种光致化学发光物质，通过测量反应所生成的光强度来测量自由基的瞬间含量（光强与自由基含量成正比）［14］。在实验中使用有光化学激发作用的光敏剂（Photosensitizer，发光氨）激发反应分子，使之在紫外灯的作用下以比正常条件下快1000倍的速度发生氧化反应，迅速产生自由基。
    
　　采用PCL-ACW-Kit方法测量人参、西洋参和三七提取物中水溶性成分的抗氧化活性。首先，配置分析混合液为 1.0 ml 反应缓冲液，包括 0.1 mol/L Sodium Carbonate (pH 10.5)和0.1 mmol/L Na2-EDTA；1.5 ml ACW-diluent (water)；1 mmol/L Luminol（25 μl），作为光敏剂激发反应分子，使其迅速产生自由基，同时又作为光致化学发光物质。样品和标准品均为10 μl。每个样品平行测试2次。

　2.4  抗氧化活性的DPPH法分析二苯基苦基苯肼自由基 (DPPH) 是一种性质较为稳定的自由基，其溶液显紫色，在 515 nm处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子由于被配对，其浓度减小而使其颜色变浅，吸光度值变小，这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学计量关系，因此可用比色法进行定量分析。清除剂直接作用于DPPH·自由基，反应时间短，用分光光度计即可测定，该方法操作简单、直接、灵敏、快速，因此DPPH分光测定法在国内外广泛用于清除自由基物质性质的研究。
    
　　取0.1 ml样品溶液，加入2 ml的60 μmol/L的DPPH溶液混匀，放置30 min，以原溶剂调零点，在515 nm处测起吸光度为Ai；同法0.1 ml溶剂+2 ml DPPH溶液混匀测定吸光度极为Ac；0.1 ml样品溶液+2 ml溶剂混匀测定吸光度极为Aj。按下述公式计算其自由基清除率。
    
　　清除率（%）=［1-（Ai-Aj）Ao］×100%
    
　　IP（％）＝［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%，其中Aj反应样品自身对吸光度的贡献；Ai样品对DPPH作用后的吸光度数值；Ac为DPPH本身在测定波长的吸收。

　　3  结果

　　3.1  提取方法的确定人参、西洋参、三七的乙醇超声提取物以及对照品的液相色谱图示于图1。分别采用3种提取方法提取3种药材中的皂苷类化合物。结果见图2。对于3种药材，超声提取的效果均较好，皂苷类化合物含量较高，且快速、安全、简便、溶剂消耗少，常温提取其成分又不会被破坏，这一结果与文献所报道一致［15］。

　　3.2  自由基清除作用的评价研究

　　3.2.1  自由基清除作用的PCL法评价研究通过采用PCL-ACW-Kit方法测定不同物质的量（0, 0.5, 1, 2 和 3 nmol）的L-ascorbic acid（抗坏血酸）得到标准曲线，即 Y= 44.489X +5.3481, R2=0.990 8。在实验中需要稀释样品溶液，以使滞后时间距落在标准曲线的线性范围内。Photochem@产生标准曲线和测试样品的抗氧化活性都是自动进行的，样品的抗氧化活性是用相当于L-ascorbic acid的纳摩尔数来计算。PCL法首次应用于皂苷类化合物的抗氧化活性研究。实验结果表明，3种中药提取物清除自由基能力有所差别，其中三七和西洋参提取物清除自由基能力比人参提取物强（见图3）。不同提取方法对于提取物的清除自由基能力有较大影响，对于三七提取物的清除能力来说，超声提取法>回流提取法>温浸提取法；西洋参和人参提取物的清除自由基能力皆是回流提取法大于超声提取法，但是二者的差异不大，而温浸提取法清除能力最弱。结果见图3。

　　3.2.2  自由基清除作用的DPPH法评价研究采用上述的PCL法评价了3种中药提取物的清除自由基能力，为了参考比较，同时采用清除DPPH自由基体外活性试验，对所提取的活性成分进行清除DPPH自由基作用的测定，对皂苷类化合物的清除自由基能力进行研究比较。各提取物对DPPH自由基清除率如图4所示。实验结果表明，3种中药的提取物对DPPH自由基的清除作用与PCL法评价的结果略有差别，但大体趋势一致，三七提取物的清除能力>西洋参提取物>人参提取物，但西洋参提取物清除自由基能力稍高于人参，相较于PCL法的评价结果相差较小（见图3～4）。而不同提取方法对提取物的清除自由基的影响与PCL法评价结果一致见图4。

　　3.3  提取物清除自由基能力的比较根据所测得到人参、西洋参、三七中的主要皂苷的总量(见图2)。同时结合提取物对自由基的清除实验，可以看出两个实验体系中所得到的提取物对自由基的清除效果基本一致（见图3～4）。对于三七的提取物来说，其清除自由基的效果随着皂苷含量的增加而显著增大，对于提取的皂苷含量，超声提取法>回流提取法>温浸提取法（见图2），其清除自由基能力也是超声提取法>回流提取法>温浸提取法（见图3～4）。而西洋参和人参提取物的皂苷含量和其清除自由基能力的趋势略有差别。实验结果表明，二者都是超声提取法提取的效果要高于回流提取；但在清除自由基实验中，回流提取法却表现出最好的清除自由基能力，超声提取法次之，但二者的差别较小；而对西洋参和人参来说皆是温浸提取法的提取的皂苷含量最低，其清除自由基能力也最弱。这可以说明皂苷的含量对于自由基的清除能力有一定的影响，而之所以在西洋参和人参的提取物中出现了皂苷含量与其清除自由基能力不相符的想象，有可能是由于回流提取法提取温度较高，提取的成分较复杂，对于自由基的清除能力产生了一定影响，这有待于进一步的研究。

　　4  结论
    
　　本实验采用超声、回流和温浸提取法对人参、西洋参和三七中的皂苷类化合物进行提取，用高效液相色谱技术定量分析了主要皂苷的含量，同时结合PCL和DPPH清除自由基体外评价体系分析皂苷类化合物的抗氧化活性，两种方法评价结果基本一致，实验结果表明，人参、西洋参和三七的皂苷乙醇提取物均具有一定的清除自由基能力，皂苷含量高的提取物，其清除自由基能力较强。PCL法可以应用于皂苷类化合物的清除自由基能力研究。

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