辛伐他汀对内毒素所致脓毒症大鼠肾组织NF?κB、iNOS表达的影响
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时间：2011年3月22日 10:49
【摘要】 目的 了解辛伐他汀对脓毒症大鼠肾组织病理变化和肾组织核转录因子?κB(NF?κB)蛋白、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法 成年SPF级雄性SD大鼠90只，随机分为A组(生理盐水静脉推注)、B组(内毒素 5mg/kg静脉推注)、C组(内毒素 5mg/kg +辛伐他汀20mg/kg，静脉推注)，每组30只。每组分别在2、4、6、12、24h时点随机处死6只大鼠，取右下肾组织，观察肾组织病理变化，免疫组化检测NF?κB蛋白及iNOS蛋白表达。结果 A组肾小球、肾小管结构正常;B组白细胞浸润，肾小管损伤明显;C组肾病理损伤减轻。A组NF?κB蛋白及iNOS蛋白表达只有微量表达，B组表达较A组增加(P<0.01)，C组表达较B组减少(P<0.05)。结论 辛伐他汀能抑制NF?κB和iNOS蛋白的过量表达，减轻脓毒症时肾组织的病理性炎症损伤。教育教学论文发表
【关键词】 脓毒症;NF?κB;一氧化氮合酶;辛伐他汀
Abstract: Objective To investigate the effect of simvastatin on the renal pathology and expression of nuclear factor kappa B (NF?κB) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in septic rats.Methods Ninety specific?pathogen free (SPF) healthy male SD rats were randomly divided into three groups:group A (intravenous saline), group B (intravenous LPS,5 mg/kg), and group C (intravenous LPS,5 mg/kg; and intravenous simvastatin, 20 mg/kg). Each group consisted of 30 animals. Six rats in each group were randomly sacrificed at 2 h, 4 h, 6 h, 12 h and 24 h, and then the right kidneys were removed. Pathological changes and NF?κB and iNOS expression were determined by histopathology and immunohistochemistry, respectively. Results There were normal glomeruli and tubules in group A, diffuse inflammatory cell infiltrate and severe tubular damage in group B, and mitigation of pathological changes in group C. Expression of NF?κB and iNOS in group B was significantly higher than that in group A and group C (P<0.01 or 0.05). Conclusion Simvastatin can ameliorate the renal pathology by down?regulation of NF?κB and iNOS expression in septic rats.Key words: sepsis; NF?κB; nitric?oxide synthase; simvastatin 脓毒症(sepsis)是具有感染证据的全身炎症反应综合征，易进展致脓毒性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(MODS)。脓毒症是威胁人类健康的重要疾病之一，全球每年有数百万人发病，且发病率还在增加，约1/4的脓毒症患者因抢救无效而死亡[1]。他汀类药物是临床常用的降脂药，近年国外研究显示，他汀类药物能改善脓毒症动物模型预后，提高生存率[2]，但目前国内少见类似报道。他汀类药价廉、安全、使用简便等优点，为此我们观察了辛伐他汀对脓毒症的疗效并初步探讨其可能的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料
90只雄性SPF级SD大鼠，体质量220～250g，购于广东医学院实验动物中心。内毒素(LPS)由美国Sigma,公司提供;辛伐他汀由美国IL公司提供;NF?κB P65及iNOS抗体由武汉博士德提供。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及处理 90只大鼠随机分成3组，每组30只，具体处理如下∶(1)A组经鼠尾静脉注射生理盐水3mL/kg和10%DMSO 2mL/kg。(2)B组经鼠尾静脉注射内毒素5.0mg/kg，再补充生理盐水至3mL/kg及10%DMSO 2mL/kg。(3)C组经鼠尾静脉注射内毒素5.0mg/kg后注射辛伐他汀针20mg/kg[3]，再补充生理盐水至3mL/kg及10%DMSO至 2mL/kg。
1.2.2 标本采集及处理 在内毒素或生理盐水注射后每组分别在2、4、6、24h时点随机取处死6只大鼠，取右下肾组织约500mg，4%甲醛固定，石蜡包埋切片。教育教学论文发表
1.2.3 病理学检测 将切片作HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。
1.2.4 免疫组化检测 NF?κB蛋白及iNOS蛋白表达∶切片常规脱蜡、水化，浸于50 mmol/ L乙二胺四乙酸溶液中,微波加热至98℃，维持10 min，修复抗原，冷却至室温，充分水洗，PBS浸洗,然后按SP免疫组化试剂盒操作说明进行，DAB显色，苏木精复染，系列乙醇脱水、透明、中性树胶封固。结果判定∶显微镜下观察肾组织细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。所有切片均在同一放大倍数(10×40)，同一光强度下分析，按等距离原则随机拍摄5 个视野，输入计算机，通过Imagepro Plus 6.0图像分析系统，测定每张切片阳性表达的积分光密度值(intergraloptical density, IOD)，IOD表示各蛋白的相对含量。
1.3 统计学处理
计量资料检测结果以均数±标准差(±s)表示，通过SPSS13.0统计软件对所得数据进行统计分析，多个样本均数比较采用方差分析(one?way ANOVA)及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠肾组织H?E染色所见
A组各时点肾小球、肾小管结构正常;B组2h开始出现炎症损伤，以6h最为显著：肾组织弥漫性单核/巨噬细胞(MΦ)浸润，组织间隙水肿明显; 上皮细胞空泡变性、肿胀，肾小管腔闭塞;C组MΦ细胞浸润较B组减轻，肾小管呈灶状损害，组织间隙水肿轻。详见图1。图1 各组大鼠肾组织H?E染色切片(400×，HE)
2.2 各组大鼠肾组织不同时间点NF?κB蛋白表达
A组各时点呈阴性表达;B组2h起呈阳性表达，至6h达高锋，12h开始下降，有明显的时效性;C组的表达及趋势与B组类似，但各时点表达较B组明显减弱，各时点积分光密度IOD值与B组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。如图2及表1。
2.3 各组大鼠肾组织不同时点iNOS蛋白表达
A组各时点表达的iNOS蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);B组2h起，呈阳性表达，至6h达高峰，12h开始下降，到24h 表达仍然高于2h水平，各时点的iNOS蛋白水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，有明显的时效性;C组的表达及趋势与B组类似，但24h时点的Inosn蛋白表达水平与2h时点水平相仿(P>0.05)，各时点表达较B组明显减弱，各时点IOD值与B组比较差异有统计学意义 (P<0.05)。如见图3及表2。图2 各组大鼠肾组织中NF?κB的表达(400×，DAB)表1 不同时点各组大鼠肾组织中NF?κB表达表2 不同时点各组大鼠肾组织中iNOS的表达 (IOD,±s，n=6)
3 讨论教育教学论文发表
脓毒症是一个复杂的病理生理过程，其中革兰阴性细菌感染占相当高的比例。LPS是革兰阴性菌的主要致病成分，可以导致机体产生严重的炎症反应，脓毒症时机体发生的各种病理变化与其密切相关。辛伐他汀是羟甲基戊二酸辅酶A(HMG?CoA)还原酶竞争性抑制剂，是继洛伐他汀之后的第二代他汀类药物，是临床常用的降脂药之一。近年研究显示，辛伐他汀具有不依赖于降脂作用的免疫调节作用[4]和抗炎作用等[5]。本文中B组以静脉注射LPS建立脓毒症大鼠模型，大鼠肾组织出现肾间质水肿，白细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、脱落等肾病理损伤。而C组加用辛伐他汀治疗，上述病理损伤明显减轻，巨噬细胞浸润减少，肾小管上皮细胞、肾间质水肿轻，提示辛伐他汀可减轻LPS所致的肾组织损伤。
NF?κB是细胞内重要的核转录因子，参与多种炎症因子基因的转录过程。当细胞受到LPS、TNF?α、IL?1和NO等刺激后，NF?κB随即活化，活化的NF?κB通过核孔复合体上的受体进入细胞核，与目的基因结合位点结合，启动和调控一系列炎症因子基因表达，介导肾脏等脏器损伤[6]。本文结果显示，正常肾组织的NF?κB表达较弱;静脉注射LPS复制脓毒症大鼠模型，脓毒症大鼠肾脏织NF?κB的表达增加;而使用辛伐他汀干预后，脓毒症大鼠肾组织中的NF?κB表达水平低于同时点B组大鼠，提示NF?κB参与脓毒症的病理生过程，辛伐他汀对脓毒症所致的NF?κB过度表达与活化有一定的抑制作用。多项研究显示在脓毒症中，NF?κB的表达及活性增加与不良预后相关[7]。李航等[8]的研究表明肾小球系膜细胞在内毒素诱导下的NF?κB的活化及TNF?α等炎性细胞因子的高表达可被洛伐他汀明显抑制，说明洛伐他汀通过抑制NF?κB活化途径抑制炎性细胞因子表达。
iNOS是NF?κB的下游效应分子[9]，而由iNOS介导NO的过度合成与释放是引起休克的重要机制之一。研究指出，源于iNOS高表达所产生的过量NO与全身感染，循环衰竭密切相关[10]。Heemskerk等[11]通过对34名志愿者静脉注入LPS，发现脓毒症志愿者中尿沉渣细胞中 iNOS表达是正常组的40倍，而且血浆中NO也相继明显增加，iNOS和NO增加的幅度与肾近曲小管损伤情度程正相关，提示近曲小管的损害iNOS大量表达和NO的过量合成有关。本文结果显示：B组iNOS表达增加， C组加用辛伐他汀后iNOS各时点表达量较B组减少。说明脓毒症大鼠肾组织iNOS表达增高，辛伐他汀可能通过抑制肾组织iNOS的表达，降低脓毒症大鼠 NO水平，保护肾脏等重要器官，防止脓毒症向脓毒性休克甚至MODS进展。
根据本文结果我们认为，脓毒症时易累及肾脏组织，辛伐他汀可能是通过抑制脓毒症时肾组织NF?κB、 iNOS蛋白的表达，减轻脓毒症时肾组织的病理性损伤。
【参考文献】
[1] Dellinger R P, Levy M M, Carlet J M, et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008[J]. Intensive Care Med，2008, 34(1):17?60.
教育教学论文发表
[2] Ando H, Takamura T, Ota T, et al. Cerivastatin improves survival of mice with lipopolysaccharide?induced sepsis [J]. Pharmacol Exp Ther, 2000, 294: 1043?1046.
[3] Zorica N, Zoran T, Radan S, et al. Single?dose intravenous simvastatin treatment attenuates renal injury in an experimental model of ischemia?reperfusion in the rat [J]. J Pharmacol Sci, 2006,(102): 413?417.
[4] Weitz?Schmidt G, Welzenbach K, Brinkmann V, et al. Statins selectively inhibit leukocyte function antigen?1 by binding to a novel regulatory integrin site[J]. Nat Med, 2001, 7(1):687?692.
[5] Pruefer D, Makowski J, Schnell M, et al. Simvastatin inhibits inflammatory properties of Staphylo?coccus aureus alpha toxin [J]. Circulation， 2003, 15(1):2104?2110.
[6] Monick M M, Hunninghake G W. Activation of second messenger pathways in alveolar macrophages by endotoxin [J]. Eur Respir J, 2002, 20(1):210?222.
[7] Arnalich F, Garcia?Palomero E, Lopez J, et al. Preditive value of nuclear factor kappaB activity and plasma cytokine levels in patients with sepsis [J]. Infect Immun,2000,68(4):1942?1945.
[8] 李航，李学旺，段琳，等.洛伐他汀对系膜细胞核因子?κB活性及炎症细胞因子表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2001, 17(4):242?245.
[9] Lim S, Kang K W, Park S Y，et al. Inhibition of lipopolysaccharide?induced inducible nitric oxide synthase expression by a novel compound, mercaptopyrazine, through suppression of nuclear factor?kappaB binding to DNA [J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4):719?728.
[10] Ma P, Danner R L. The many faces of sepsis?induced vascular failure [J]. Crit Care Med, 2002, 30(4):947?949.
[11] Heemskerk S, Pickkers P, Bouw M P et al. Up?regulation of renal iNOS during human endotoxemia and sepsis is associated with proximal tubule injury [J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2006,1(4):853?862.教育教学论文发表
【关键词】 脓毒症;NF?κB;一氧化氮合酶;辛伐他汀
Abstract: Objective To investigate the effect of simvastatin on the renal pathology and expression of nuclear factor kappa B (NF?κB) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in septic rats.Methods Ninety specific?pathogen free (SPF) healthy male SD rats were randomly divided into three groups:group A (intravenous saline), group B (intravenous LPS,5 mg/kg), and group C (intravenous LPS,5 mg/kg; and intravenous simvastatin, 20 mg/kg). Each group consisted of 30 animals. Six rats in each group were randomly sacrificed at 2 h, 4 h, 6 h, 12 h and 24 h, and then the right kidneys were removed. Pathological changes and NF?κB and iNOS expression were determined by histopathology and immunohistochemistry, respectively. Results There were normal glomeruli and tubules in group A, diffuse inflammatory cell infiltrate and severe tubular damage in group B, and mitigation of pathological changes in group C. Expression of NF?κB and iNOS in group B was significantly higher than that in group A and group C (P<0.01 or 0.05). Conclusion Simvastatin can ameliorate the renal pathology by down?regulation of NF?κB and iNOS expression in septic rats.Key words: sepsis; NF?κB; nitric?oxide synthase; simvastatin 脓毒症(sepsis)是具有感染证据的全身炎症反应综合征，易进展致脓毒性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合征(MODS)。脓毒症是威胁人类健康的重要疾病之一，全球每年有数百万人发病，且发病率还在增加，约1/4的脓毒症患者因抢救无效而死亡[1]。他汀类药物是临床常用的降脂药，近年国外研究显示，他汀类药物能改善脓毒症动物模型预后，提高生存率[2]，但目前国内少见类似报道。他汀类药价廉、安全、使用简便等优点，为此我们观察了辛伐他汀对脓毒症的疗效并初步探讨其可能的分子机制。
1 材料和方法
1.1 材料
90只雄性SPF级SD大鼠，体质量220～250g，购于广东医学院实验动物中心。内毒素(LPS)由美国Sigma,公司提供;辛伐他汀由美国IL公司提供;NF?κB P65及iNOS抗体由武汉博士德提供。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组及处理 90只大鼠随机分成3组，每组30只，具体处理如下∶(1)A组经鼠尾静脉注射生理盐水3mL/kg和10%DMSO 2mL/kg。(2)B组经鼠尾静脉注射内毒素5.0mg/kg，再补充生理盐水至3mL/kg及10%DMSO 2mL/kg。(3)C组经鼠尾静脉注射内毒素5.0mg/kg后注射辛伐他汀针20mg/kg[3]，再补充生理盐水至3mL/kg及10%DMSO至 2mL/kg。
1.2.2 标本采集及处理 在内毒素或生理盐水注射后每组分别在2、4、6、24h时点随机取处死6只大鼠，取右下肾组织约500mg，4%甲醛固定，石蜡包埋切片。教育教学论文发表
1.2.3 病理学检测 将切片作HE染色，光镜下观察肾组织病理变化。
1.2.4 免疫组化检测 NF?κB蛋白及iNOS蛋白表达∶切片常规脱蜡、水化，浸于50 mmol/ L乙二胺四乙酸溶液中,微波加热至98℃，维持10 min，修复抗原，冷却至室温，充分水洗，PBS浸洗,然后按SP免疫组化试剂盒操作说明进行，DAB显色，苏木精复染，系列乙醇脱水、透明、中性树胶封固。结果判定∶显微镜下观察肾组织细胞内出现棕黄色颗粒为阳性表达。所有切片均在同一放大倍数(10×40)，同一光强度下分析，按等距离原则随机拍摄5 个视野，输入计算机，通过Imagepro Plus 6.0图像分析系统，测定每张切片阳性表达的积分光密度值(intergraloptical density, IOD)，IOD表示各蛋白的相对含量。
1.3 统计学处理
计量资料检测结果以均数±标准差(±s)表示，通过SPSS13.0统计软件对所得数据进行统计分析，多个样本均数比较采用方差分析(one?way ANOVA)及q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠肾组织H?E染色所见
A组各时点肾小球、肾小管结构正常;B组2h开始出现炎症损伤，以6h最为显著：肾组织弥漫性单核/巨噬细胞(MΦ)浸润，组织间隙水肿明显; 上皮细胞空泡变性、肿胀，肾小管腔闭塞;C组MΦ细胞浸润较B组减轻，肾小管呈灶状损害，组织间隙水肿轻。详见图1。图1 各组大鼠肾组织H?E染色切片(400×，HE)
2.2 各组大鼠肾组织不同时间点NF?κB蛋白表达
A组各时点呈阴性表达;B组2h起呈阳性表达，至6h达高锋，12h开始下降，有明显的时效性;C组的表达及趋势与B组类似，但各时点表达较B组明显减弱，各时点积分光密度IOD值与B组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。如图2及表1。
2.3 各组大鼠肾组织不同时点iNOS蛋白表达
A组各时点表达的iNOS蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);B组2h起，呈阳性表达，至6h达高峰，12h开始下降，到24h 表达仍然高于2h水平，各时点的iNOS蛋白水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，有明显的时效性;C组的表达及趋势与B组类似，但24h时点的Inosn蛋白表达水平与2h时点水平相仿(P>0.05)，各时点表达较B组明显减弱，各时点IOD值与B组比较差异有统计学意义 (P<0.05)。如见图3及表2。图2 各组大鼠肾组织中NF?κB的表达(400×，DAB)表1 不同时点各组大鼠肾组织中NF?κB表达表2 不同时点各组大鼠肾组织中iNOS的表达 (IOD,±s，n=6)
3 讨论教育教学论文发表
脓毒症是一个复杂的病理生理过程，其中革兰阴性细菌感染占相当高的比例。LPS是革兰阴性菌的主要致病成分，可以导致机体产生严重的炎症反应，脓毒症时机体发生的各种病理变化与其密切相关。辛伐他汀是羟甲基戊二酸辅酶A(HMG?CoA)还原酶竞争性抑制剂，是继洛伐他汀之后的第二代他汀类药物，是临床常用的降脂药之一。近年研究显示，辛伐他汀具有不依赖于降脂作用的免疫调节作用[4]和抗炎作用等[5]。本文中B组以静脉注射LPS建立脓毒症大鼠模型，大鼠肾组织出现肾间质水肿，白细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀、脱落等肾病理损伤。而C组加用辛伐他汀治疗，上述病理损伤明显减轻，巨噬细胞浸润减少，肾小管上皮细胞、肾间质水肿轻，提示辛伐他汀可减轻LPS所致的肾组织损伤。
NF?κB是细胞内重要的核转录因子，参与多种炎症因子基因的转录过程。当细胞受到LPS、TNF?α、IL?1和NO等刺激后，NF?κB随即活化，活化的NF?κB通过核孔复合体上的受体进入细胞核，与目的基因结合位点结合，启动和调控一系列炎症因子基因表达，介导肾脏等脏器损伤[6]。本文结果显示，正常肾组织的NF?κB表达较弱;静脉注射LPS复制脓毒症大鼠模型，脓毒症大鼠肾脏织NF?κB的表达增加;而使用辛伐他汀干预后，脓毒症大鼠肾组织中的NF?κB表达水平低于同时点B组大鼠，提示NF?κB参与脓毒症的病理生过程，辛伐他汀对脓毒症所致的NF?κB过度表达与活化有一定的抑制作用。多项研究显示在脓毒症中，NF?κB的表达及活性增加与不良预后相关[7]。李航等[8]的研究表明肾小球系膜细胞在内毒素诱导下的NF?κB的活化及TNF?α等炎性细胞因子的高表达可被洛伐他汀明显抑制，说明洛伐他汀通过抑制NF?κB活化途径抑制炎性细胞因子表达。
iNOS是NF?κB的下游效应分子[9]，而由iNOS介导NO的过度合成与释放是引起休克的重要机制之一。研究指出，源于iNOS高表达所产生的过量NO与全身感染，循环衰竭密切相关[10]。Heemskerk等[11]通过对34名志愿者静脉注入LPS，发现脓毒症志愿者中尿沉渣细胞中 iNOS表达是正常组的40倍，而且血浆中NO也相继明显增加，iNOS和NO增加的幅度与肾近曲小管损伤情度程正相关，提示近曲小管的损害iNOS大量表达和NO的过量合成有关。本文结果显示：B组iNOS表达增加， C组加用辛伐他汀后iNOS各时点表达量较B组减少。说明脓毒症大鼠肾组织iNOS表达增高，辛伐他汀可能通过抑制肾组织iNOS的表达，降低脓毒症大鼠 NO水平，保护肾脏等重要器官，防止脓毒症向脓毒性休克甚至MODS进展。
根据本文结果我们认为，脓毒症时易累及肾脏组织，辛伐他汀可能是通过抑制脓毒症时肾组织NF?κB、 iNOS蛋白的表达，减轻脓毒症时肾组织的病理性损伤。
【参考文献】
[1] Dellinger R P, Levy M M, Carlet J M, et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008[J]. Intensive Care Med，2008, 34(1):17?60.
教育教学论文发表
[2] Ando H, Takamura T, Ota T, et al. Cerivastatin improves survival of mice with lipopolysaccharide?induced sepsis [J]. Pharmacol Exp Ther, 2000, 294: 1043?1046.
[3] Zorica N, Zoran T, Radan S, et al. Single?dose intravenous simvastatin treatment attenuates renal injury in an experimental model of ischemia?reperfusion in the rat [J]. J Pharmacol Sci, 2006,(102): 413?417.
[4] Weitz?Schmidt G, Welzenbach K, Brinkmann V, et al. Statins selectively inhibit leukocyte function antigen?1 by binding to a novel regulatory integrin site[J]. Nat Med, 2001, 7(1):687?692.
[5] Pruefer D, Makowski J, Schnell M, et al. Simvastatin inhibits inflammatory properties of Staphylo?coccus aureus alpha toxin [J]. Circulation， 2003, 15(1):2104?2110.
[6] Monick M M, Hunninghake G W. Activation of second messenger pathways in alveolar macrophages by endotoxin [J]. Eur Respir J, 2002, 20(1):210?222.
[7] Arnalich F, Garcia?Palomero E, Lopez J, et al. Preditive value of nuclear factor kappaB activity and plasma cytokine levels in patients with sepsis [J]. Infect Immun,2000,68(4):1942?1945.
[8] 李航，李学旺，段琳，等.洛伐他汀对系膜细胞核因子?κB活性及炎症细胞因子表达的影响[J].中华肾脏病杂志，2001, 17(4):242?245.
[9] Lim S, Kang K W, Park S Y，et al. Inhibition of lipopolysaccharide?induced inducible nitric oxide synthase expression by a novel compound, mercaptopyrazine, through suppression of nuclear factor?kappaB binding to DNA [J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(4):719?728.
[10] Ma P, Danner R L. The many faces of sepsis?induced vascular failure [J]. Crit Care Med, 2002, 30(4):947?949.
[11] Heemskerk S, Pickkers P, Bouw M P et al. Up?regulation of renal iNOS during human endotoxemia and sepsis is associated with proximal tubule injury [J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2006,1(4):853?862.教育教学论文发表
