TNFα?Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

【摘要】  构建携带绿色荧光蛋白的TNFα?Tumstatin融合基因腺病毒表达载体，转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)。方法： 设计含有GM?CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物，PCR扩增TNFα?Tumstatin，将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack?CMV上，重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy?1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒，酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞，经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果： 重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定，证实含有TNFα?Tumstatin融合基因，测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论： 成功构建了TNFα?Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体，能高效率感染hUCMSCs，为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。 快速论文发表

【关键词】  腺病毒载体 融合基因 同源重组 细胞转染

    ［Abstract］  Objective: To construct green fluorescence protein (GFP)labeled recombinant adenovirus vector carrying TNFα?Tumstatin fusion gene and transfect it into hUCMSCs. Methods： The amplification products of TNFα?Tumstatin by PCR with a pair of primers with BglⅡand HindⅢ restriction endonuclease sites and signal peptide sequence of GM?CSF were subcloned into shuttle plasmid pAdtrack?CMV after digesting with BglⅡand HindⅢ. The resultant plasmid, after linearized by digesting with restriction endonuclease PmeⅠ, was transformed into E.coli.BJ5183 that had been transformed by adenoviral backbone plasmid pAdEasy?1. Recombinant plasmid were obtained by alternation of kanamycin and then confirmed by PCR and restriction endonuclease analysis. The adenovirus was packaged and propagated in human embryonal kidney cells (293A cells)after being linearized by digesting with restriction endonuclease PacⅠand then was transfected into hUCMSCs. Fusion gene expression in infected hUCMSCs was detected by RT?PCR.  Results： The results of PCR and restriction endonuclease assay indicated that target gene was inserted into recombinant adenovirus vector successfully. The sequence of fusion gene was the same as that of designed fragments. hUCMSCs infected by the recombinant adenovirus expressed GFP and fusion gene which could be demonstrated by fluorescence microscope and RT?PCR respectively.  Conclusion： Recombinant adenovirus vector containing TNFα?Tumstatin has been constructed successfully and could transfected hUCMSCs efficiently, which laid a foundation for further investigation of anti?tumor effect of hUCMSCs modified with TNFα?Tumstatin.快速论文发表

    ［Key words］  adenovirus vector;  fusion gene;  homologous recombination;  cell transfection

    TNFα对肿瘤细胞有直接的毒性作用，对肿瘤血管也有一定的破坏效应。然而临床上使用TNFα存在抑制肿瘤效率低、剂量高和毒副作用强等问题。Tumstatin能抑制肿瘤血管新生来发挥抗肿瘤的效应。Luo等［1］构建的双功能融合蛋白TNFα?Tumstatin有望克服TNFα应用剂量高、毒副作用强的缺点，发挥二者联合抗肿瘤作用。为此我们以TNFα?Tumstatin融合基因为目的基因，构建了绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）标记的重组腺病毒表达载体，初步探讨其在人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUCMSCs)中的表达，为开展融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤研究奠定实验基础。快速论文发表

    1  材料与方法

    1.1  材  料

    1.1.1  菌株、质粒和细胞株  E.coli.DH5α菌株，E.coli.BJ5183菌株为本室保存；PBV220?TNFα?Tumstatin由安徽省立医院检验科罗以勤等提供；pAdTrack?CMV和pAdEasy?1由南京师范大学生命科学院惠赠；人胚肾293A细胞株购自南京凯基科技发展有限公司。

    1.1.2  主要试剂  限制性核酸内切酶BglⅡ，HindⅢ，PmeⅠ，PacⅠ为Biolabs公司产品；T4DNA连接酶， LATaq酶，反转录试剂盒为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；胶回收试剂盒，磷酸钙转染试剂盒为Promega公司产品。

    1.1.3  主要仪器  二氧化碳培养箱（Forma, Scientific公司），倒置式生物显微镜（TE300，Nikon公司）PCR仪（ABI2700），核酸紫外检测仪（Biophotometer，Eppendorf公司），全自动凝胶成像系统（SYNGENE，GENE公司）。

    1.2  方  法

    1.2.1  PCR引物设计  采用primer premier 5.0软件设计两对引物用于扩增融合基因，序列和扩增长度见表1，在每条引物的前端加入相应的限制性酶切位点和保护性碱基，上游引物下划线部分为BglⅡ酶切位点，下游引物下划线部分为HindⅢ酶切位点。其中TNF?Tumstatin?1上游引入GM?CSF信号肽序列，TNF?Tumstatin?2用于PCR鉴定。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表1  PCR引物序列

    1.2.2  重组穿梭质粒pAdTrack/TNFα?Tumstatin的构建  以质粒PBV220?TNFα?Tumstatin为模板，用引物TNF?Tumstatin?1进行PCR扩增，反应体系为25 μl，其中含10×PCR缓冲液2.5 μl，dNTP (2.5 μmol/l)2.5 μl，模板质粒 (500 μg/ml)0.5 μl, 上下游引物（25 μmol/l）各0.5 μl, LATaq DNA聚合酶0.2 μl，用ddH2O补足至25 μl。PCR循环程序为94℃预变性5 min, 94℃变性30 s， 63℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后72℃再延伸10 min结束反应。胶回收PCR产物，获得TNFα?Tumstatin目的片段，将目的片段和穿梭载体pAdTrack?CMV同时用BglⅡ和HindⅢ 双酶切，然后切胶回收，分别获得825 bp和9.2 kb的基因片段。纯化后，将目的基因片段与载体经T4 DNA连接酶16℃连接过夜，将TNFα?Tumstatin片段插入穿梭质粒中的相同位点，转化大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆，经PCR及BglⅡ和HindⅢ酶切验证，获得重组穿梭质粒pAdTrack/TNFα?Tumstatin。

    1.2.3  重组腺病毒质粒pAdGFP/TNFα?Tumstatin的构建及测序  将重组穿梭质粒pAdTrack/TNFα?Tumstatin用PmeⅠ酶切线性化，转化入制备好的含有腺病毒骨架质粒pAdEasy?1的BJ5183感受态细菌中，使pAdEasy?1与pAdTrack/TNFα?Tumstatin在BJ5183中同源重组。卡那霉素平板筛选，挑取较小的克隆，摇菌过夜，提取质粒，用PCR法鉴定初筛阳性重组腺病毒质粒。用PacⅠ酶切鉴定正确后，将阳性克隆pAdGFP/TNFα?Tumstatin转入大肠埃希菌DH5α中，大量扩增后提取质粒。

    同时构建不含融合基因的空腺病毒质粒pAdGFP作为对照，方法同上。

    将pAdGFP/TNFα?Tumstatin转化的DH5α菌液送上海生工生物工程公司测序。

    1.2.4  293A细胞和hUCMSCs的培养  复苏293A细胞一支，加入含10%胎牛血清的L?DMEM培养液中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养；按照本室建立的方法培养获得hUCMSCs［2］，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

    1.2.5  重组腺病毒AdGFP/TNFα?Tumstatin的转染包装及扩增  将重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后以磷酸钙介导转染293A细胞。将PmeⅠ线性化的pAd GFP/TNFα?Tumstatin重组质粒、H2O和氯化钙共250 μl形成混合体系，缓缓加入250 μl 2×HEPES盐缓冲液中，边滴加边涡旋振荡。将上述混合体系静置30 min后加入60%～80%融合的293A细胞中，16～24 h换液，24 h可见绿色荧光，72 h后收集293A细胞，?70℃和37℃反复冻融3次，裂解细胞，离心收集病毒。取适量病毒液加入70%融合的293A细胞中，37℃、5%CO2孵箱中培养，镜下可见较强的绿色荧光及细胞病变。将病毒液反复感染293A细胞3次，大量扩增病毒，将病毒液用孔径0.45 μm的无菌滤器过滤，测定病毒滴度，-70℃保存备用。

    1.2.6  重组腺病毒AdGFP/TNFα?Tumstatin感染hUCMSCs  将病毒液加入生长状态良好的hUCMSCs，加入病毒液前2 h换新鲜培养液，细胞80％融合，贴壁良好。加入病毒液后24 h后荧光显微镜下可见荧光，72 h时可见90％以上hUCMSCs带有绿色荧光。

    1.2.7  RT?PCR检测hUCMSCs中TNFα?Tumstatin融合基因的表达  将hUCMSCs、感染空载体AdGFP的hUCMSCs和感染AdGFP/TNFα?Tumstatin的hUCMSCs提取总RNA，然后RT?PCR检测3组hUCMSCs中TNFα?Tumstatin的表达，PCR反应体系和条件同1.2.2。快速论文发表

    2  结  果

    2.1  重组穿梭质粒pAdTrack/TNFα?Tumstatin的鉴定

    重组穿梭质粒经PCR鉴定，可见到835 bp的目的基因片段(图1a)；用BglⅡ、HindⅢ 双酶切验证阳性克隆，电泳可见约9.2 kb和825 bp两个片段，与相应载体及目的片段的大小相符合(图1b)。

    a：PCR鉴定电泳图；b：酶切鉴定电泳图，M：DNA标准（DL2000）； 1～4为4个单个克隆

    图1  重组穿梭质粒pAdTrack/TNFα?Tumstatin鉴定结果

    Fig 1   Identification of pAdTrack/TNFα?Tumstatin

    2.2  重组腺病毒质粒pAdGFP/TNFα?Tumstatin的鉴定

    PCR方法证实目的基因片段已经插入重组腺病毒质粒(图2a)；用PacⅠ酶切验证完全重组腺病毒质粒，酶切可见30 kb和4.5 kb或3.0 kb大小的片段 (图2b)。挑选阳性克隆测序，结果与原序列比对完全一致，证实为融合基因TNFα?Tumstatin。

    2.3  重组腺病毒AdGFP/TNFα?Tumstatin转染293A细胞

    通过GFP的表达观察重组腺病毒在293A细胞内的转染情况。正常293细胞呈多角形，重组腺病毒感染24 h后，可见到较强的绿色荧光，同时细胞变圆，胞核增大，逐渐从壁上脱落悬浮，出现病变效应(图3)。

    2.4  重组腺病毒AdGFP/TNFα?Tumstatin感染hUCMSCs

    用重组腺病毒感染hUCMSCs，24 h可见GFP微弱表达，72 h后，荧光强度明显增强，表达GFP的细胞达90%以上（图4）。

    2.5  重组腺病毒AdGFP/TNFα?Tumstatin感染后融合基因的表达

    RT?PCR分析结果表明,AdGFP/TNFα?Tumstatin感染后hUCMSCs表达TNFα?Tumstatin融合基因，而hUCMSCs和感染AdGFP的hUCMSCs均未见融合基因的表达。205 bp的片段为内参基因GAPDH(图5)。快速论文发表

    3  讨  论

    重组腺病毒载体作为介导基因转染和表达的重要工具，可介导外源基因短时高水平表达，感染分裂期和静止期细胞，不与宿主细胞染色体整合，无插入突变，诱发癌变的风险较低［3］，且易于制备，病毒滴度高，成为基因工程研究中最常用的载体之一。本研究选用的腺病毒重组系统，带有GFP报告基因，可在荧光显微镜下直接观察，判断基因转染的成败和效率，具有简单、直观的优点。

    间质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多向分化潜能和向损伤组织趋化的特性，免疫原性低，甚至下调免疫应答［4］，是理想的组织工程细胞和基因治疗的载体细胞。MSCs作为载体细胞进行基因治疗已成为国内外学者研究的热点，并且取得了较为理想的临床疗效［5，6］。本室从脐带中培养出MSCs，其生物学特性与骨髓MSCs没有显著的差异，较骨髓MSCs更易于分离、培养和扩增 ［2］。因此，本研究选用hUCMSCs作为基因治疗研究的载体细胞，为以后深入研究和临床应用有方便、充足的细胞来源提供了可能。

    TNFα的抗肿瘤作用及Tumstatin的抗肿瘤新生血管生成作用已被许多的实验研究所证实［7,8］。TNFα?Tumstatin双功能融合基因的构建为肿瘤的治疗开辟了一个新的途径。因此，本研究选用TNFα?Tumstatin融合基因作为目的基因，构建带有GFP标记的重组腺病毒表达载体。酶切和PCR鉴定的结果均与预期结果相符，测序结果也与设计片段一致，表明重组腺病毒质粒构建成功。体外转染293A细胞，可见GFP表达，并可反复感染，表明重组病毒成功包装，可以大量扩增。利用重组腺病毒介导融合基因修饰hUCMSCs，旨在进一步研究TNFα?Tumstatin融合基因导入hUCMSCs后，合成的融合蛋白能否发挥对肿瘤组织的新生血管和肿瘤细胞杀伤和抑制作用以及效果如何。初步结果显示重组腺病毒感染hUCMSCs效率较高，融合基因在hUCMSCs中获得表达，这提示了进一步研究hUCMSCs表达融合蛋白抗肿瘤的可行性，为进一步研究基因修饰hUCMSCs体外和体内抗肿瘤效应打下了实验基础。快速论文发表

【参考文献】
  ［1］ Luo YQ, Wang LH, Ma XL, et al. Construction, expression, and characterization of a new targeted bifunctional fusion protein: tumstatin45?132?TNF［J］. IUBMB Life, 2006, 58(11):647-653.

［2］ Qiao C, Xu W, Zhu W, et al. Human mesenchymal stem cells isolated from umbilical cord［J］. Cell Biol Int, 2008,32(1): 8-15.

［3］ Cao B, Mytinger JR, Huard J. Adenovirus mediated gene transfer to skeletal muscle［J］. Microsc Res Tech, 2002, 58(1): 45-51.

［4］ 毛 飞,许文荣,许化溪,等. 骨髓间质干细胞下调免疫反应的实验研究［J］.中国免疫学杂志,2006,22(2):629-635.

［5］ Nakamura K, Ito Y, Kawano Y, et al. Antitumor effect of genetically engineered mesenchymal stem cells in a rat glioma model［J］. Gene Ther, 2004,11(14):1155-1164.

［6］ Kurozumi K, Nakamura K, Tamiya T, et al. Mesenchymal stem cells that produce neurotrophic factors reduce ischemic damage in the rat middle cerebral artery occlusion model［J］. Mol Ther, 2005, 11(1): 96-104.

［7］ Maeshima Y, Manfredi M,Reimer C, et al. Identification of the anti?angiogenic site within vascular basement membrane?derived tumstatin［J］. J Biol Chem, 2001,276(18):15240-15248.快速论文发表