转染Smad3基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI?1表达的改变

【摘要】  通过对大鼠肾小球系膜细胞（MsC）转染Smad3基因，观察转染阳性细胞克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子?1(PAI?1)表达的改变，以进一步阐明转移生长因子?β（TGF?β）介导肾小球硬化发生的作用机制。方法： 经脂质体介导将含有Smad3重组表达质粒转染大鼠MsC，用G418筛选及RT?PCR，Western blot法鉴定；又分别采用RT?PCR与Western blot法，检测转染阳性细胞克隆uPA及PAI?1表达改变。 结果： 成功建立高表达Smad3的阳性MsC克隆（Th?8，Th?15），并证实其uPA mRNA及蛋白表达明显降低，而PAI?1 mRNA及其蛋白的表达显著增加。结论： TGF?β可能通过上调Smad3而减少组织内uPA的生成和增加PAI?1的合成，从而促进肾小球硬化的进展。 期刊论文发表

【关键词】  系膜细胞 Smad3 尿激酶型纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制因子?1

    ［Abstract］  Objective: To elucidate the mechanism of the role of TGF?β in the development of glomerulosclerosis by observing urokinase?type plasminogen activator(uPA)and plasminogen activator inhibitor?1(PAI?1)expressions on cultured rat mesangial cells(MsC)transfected with Smad3 cDNA. Methods： Lipofectin method was used to transfect Smad3 cDNA into rat MsC, RT?PCR and Western blot analysis for detecting Smad3 mRNA and protein expression level.The expressions of uPA and PAI?1 were also determined by RT?PCR and Western blot. Results： Overexpression of Smad3 on two transfected MsC clones (Th?8，Th?15)were successfully established.Two MsC clones showed decreased expressions of uPA mRNA and its protein accompanied with increased synthesis of PAI?1 mRNA and its protein. Conclusion： It is possible that TGF?β mediates the development of glomerulosclerosis by upregulating Smad3 expression, which decreasing the expression of uPA and increasing the synthesis of PAI?1.

    ［Key words］  mesangial cell;  Smad3;  urokinase?type plasminogen activator plasminogen activator inhibitor?1

    大量研究表明，转化生长因子?β（transforming growth factor?β,TGF?β）的作用是介导肾小球硬化发生的共同通路［1］。TGF?β通过与靶细胞膜上的相关受体（Tβ?R）结合，磷酸化激活信号转导分子Smad2和Smad3后与Smad4形成异聚体转移至核内，并在核内相关因子的共同作用下，参与对一些靶基因表达的调节［2］。体外培养的肾小球系膜细胞（mesangial cell,MsC）有Smad2，Smad3和Smad4存在，可被TGF?β1激活并参与纤溶酶原激活物抑制因子?1（plasminogen activator inhibitor?1，PAI?1）及Ⅰ型胶原的转录过程［3,4］。最近我们运用细胞转基因技术发现Smad7介导了肾小球MsC基质降解酶系统代谢过程，且其可能为阻止肾小球硬化发生的重要机制［5］。本实验将Smad3 cDNA重组质粒经脂质体介导转染大鼠MsC，观察转基因MsC克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase?type plasminogen activator,uPA)及PAI?1的表达，以进一步阐明TGF?β介导肾小球硬化发生的作用机制。期刊论文发表

    1  材料和方法

    1.1  重组Smad3真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备

    pcDNA3.0?Smad3（日本Dr.Takeshi Imamuna 馈赠）经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定，送测序（联合基因公司）后大量扩增，QIAGEN Kit纯化。

    1.2  Smad3基因对MsC转染和阳性细胞克隆的筛选

    实验用MsC为第8代，其制备及鉴定可参阅已报道的常规方法［6］。融合生长的细胞以1×106细胞数转入6孔板内，到呈现30%～50%融合生长时，弃完全培养液，分别加含有Lipofectin(Gibcobrl公司)和pcDNA3.0?Smad3或Lipofectin和pcDNA3.0混合液的无血清培养液（Sigma公司）1 ml，20 h后弃无血清培养液，加入含20%血清的完全培养液，72 h后再改用含G418（600 μg/ml，Gibcobrl公司）的完全培养液。20 d后克隆形成，将其种入24孔板中，直至生长至融合，再转入6孔板，最后转入100 ml培养瓶中。

    1.3  对含有Smad3 MsC克隆的鉴定

    1.3.1  RT?PCR法  阳性克隆细胞生长至亚融合时，用Trizol（Gibcobrl公司）抽提总RNA，反转录成cDNA（Promega公司）,等量cDNA依照Advantage cDNA PCR kit(Clontech公司)提供的步骤进行PCR。其引物如下：内参照GAPDH（上游5′?ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC?3′;下游5′?CCACCACCCTGTTGCTGTAG?3′，预计扩增片段长度为450 bp）。 Smad3(上游5′?TCTTGTGTCTAAGAGAGTTGA?3′; 下游5′?TCCAGTCCAGGAGAAAGGCAC?3′，预计扩增片段长度为363 bp)。

    1.3.2  Western blot法  阳性细胞克隆生长至亚融合时，弃完全培养液，PBS洗2次，20 μl蛋白依标准方法进行8%SDS?PAGE变性电泳，转移至PVDF膜。一抗为山羊抗小鼠Smad3多克隆抗体（1∶200，Oncogene公司），二抗为生物素化兔抗山羊IgG（1∶500，ABC Kit）。

    1.4  RT?PCR法检测uPA与PAI?1 mRNA

    阳性细胞克隆生长至亚融合时，用Trizol（Gibcobrl公司）抽提总RNA，反转录成cDNA（Promega公司）,等量cDNA依照Advantage cDNA PCR kit(Clontech公司)提供的步骤进行PCR。PCR引物如下：内参照GAPDH同上。uPA(上游5′?AATCGAACTGTGGCTGTC?3′; 下游5′?ATCCCTCTTTCTTCTCAAGG?3′，预计扩增片段长度为406 bp)。PAI?1（上游5′?CCTCTCCGCCATCACCAACA?3′；下游5′?TGTGCCGCTCTCGTTCACCT?3′，预计扩增片段长度为261 bp）。

    1.5  Western blot法检测uPA与PAI?1蛋白

    阳性细胞克隆生长至亚融合时，弃完全培养液，PBS洗3次，取20 μl蛋白依标准方法分别作8% SDS?PAGE变性电泳，转移至PVDF膜。一抗分别为鼠抗人uPA多克隆抗体(1∶200，复旦大学朱运松教授馈赠)及鼠抗人PAI?1单克隆抗体(1∶200，Oncogene公司)，二抗分别为生物素化马抗鼠IgG（1∶500，ABC Kit）。期刊论文发表

    1.6  定量和统计分析

    用Kodak Digital Science 1D测定条带的积分光密度，经SPSS 9.0统计软件对数据进行标准差计算和t检验。

    2  结  果

    2.1  重组真核表达质粒pcDNA3.0?Smad3的鉴定

    经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定，证明Smad3基因已被正确地重组至pcDNA3.0载体中(图1)，其两端测序结果显示,与基因库中大鼠Smad3序列完全一致。

    2.2  转染Smad3 cDNA 的MsC鉴定

    转染的MsC经G418筛选后，共获得32个克隆。RT?PCR结果显示，Th?8与Th?15阳性细胞克隆Smad3 mRNA的表达显著增高（图2）。Western blot结果显示，Th?8与Th?15细胞克隆Smad3蛋白表达明显增高，显示相对分子质量约为48 000蛋白条带（图3）。

    2.3  阳性MsC克隆uPA mRNA与蛋白表达的改变

    经RT?PCR检测，Th?8与Th?15细胞克隆uPA mRNA的表达明显降低（图4）。Western blot结果显示，其uPA蛋白表达比对照组降低约48%，其相对分子质量为50 000(图5)。

    2.4  阳性MsC克隆PAI?1 mRNA与蛋白表达的改变

    经RT?PCR检测，Th?8与Th?15细胞克隆PAI?1 mRNA的表达明显增加（图6）。Western blot结果显示，其PAI?1蛋白表达比对照组高约2.3倍，其相对分子质量为45 000(图7)。期刊论文发表

    3  讨  论

    大量实验研究表明，细胞外基质（extraccellular matrix,ECM）在肾小球内的沉积并导致肾小球硬化的发生，是基质降解酶及其组织内抑制物失衡所致，其中纤溶酶及其抑制剂是参与肾小球硬化过程的一个重要降解酶系统。研究证实，PAs分为组织型（tPA）和尿激酶型（uPA）两种，它们均可激活纤溶酶原（plasminogen）,使之转变为纤溶酶（plasmin），后者可降解多种ECM成分（如纤连蛋白、波形蛋白等），同时还能使非活性形式的MMP?2转变为活性型，提高其降解ECM能力。其中uPA在ECM降解和重塑过程中发挥了极其重要的作用。而PAI?1则是uPA和tPA的天然抑制剂,通过形成复合物而使uPA和tPA失去活性，促进ECM在肾小球内的沉积及肾小球硬化过程的进展。大量研究证实，人类多种肾小球疾病，如系膜增生型肾小球肾炎、新月体型肾小球肾炎、局灶节段性肾小球硬化等，均伴随TGF?β表达增加。有作者运用细胞转基因技术发现，过表达TGF?β1的大鼠MsC PAI?1 mRNA及其蛋白表达增加，而低表达TGF?β1的大鼠MsC PAI?1 mRNA及其蛋白表达降低［7］。

    目前对于TGF?β信号转导通路下游重要的信号转导分子Smad家族的实验研究，已成为探讨其促进肾小球损伤和硬化作用机制的一个热点。最近Sato等［8］报道，在TGF?β信号通路所介导的组织纤维化（或硬化）过程中，受体激活型Smad成员Smad3作用尤为重要。而运用转基因技术，观察Smad3对MsC uPA与PAI?1表达的影响，国内外尚未见报道。本实验采用细胞转基因技术，获得稳定表达Smad3的肾小球MsC克隆，发现该细胞克隆uPA mRNA及蛋白表达显著减少，而PAI?1 mRNA及蛋白表达明显上调，这无疑表明Smad3也介导了肾小球MsC纤溶酶系统的代谢过程。因此我们有理由认为TGF?β可能通过Smad3而减少肾小球内uPA的表达及增加PAI?1的合成，进而促进肾小球硬化的发生发展过程。期刊论文发表

【参考文献】
  ［1］ Togawa A, Yamamoto T, Suzuki T, et al.Ubiquitin?dependent degradation of Smad2 Is increased in the glomeruli of rats with anti?thymocyte serum nephritis［J］.Am J Path,2003,163(4):1645-1652.

［2］ Long J，Matsuura I, He D,et al.Repression of Smad transcriptional activity by PIASy, an inhibitor of activated STAT［J］.PNAS, 2003,100(17):9791-9796.

［3］ Kanasaki K, Koya D, Sugimoto T, et al.N?Acetyl?Seryl?Aspartyl?Lysyl?Proline Inhibits TGF?β?Mediated Plasminogen Activator Inhibitor?1 Expression via Inhibition of Smad Pathway in Human Mesangial Cells［J］.J Am Soc Nephrol, 2003,14(4):863-872.

［4］ Kleiter I, Pedre X, Mueller AM, et al.Inhibition of Smad7, a negative regulator of TGF?beta signaling, suppresses autoimmune encephalomyelitis［J］.J Neuroimmunol,2007,187(1/2):61-73.

［5］ 于 鸿，郭慕依，王小刚，等.转染Smad7基因的大鼠肾系膜细胞基质金属蛋白酶2及其组织抑制因子2表达的改变［J］.中华病理学杂志，2003，32(6)：544-547.

［6］ 张 明，郭慕依，陈 琦，等.大鼠肾小球系膜细胞培养［J］.上海医科大学学报,1995,22(3):207-209.

［7］ 林文生，张 农，张颂文，等.TGF?β1对大鼠系膜细胞增殖和纤溶酶原激活物及其抑制剂表达的影响［J］.复旦学报:医学科学版, 2001，28(3)：213-214.

［8］ Sato M, Muragaki Y, Saika S,et al.Targeted disruption of TGF?β1/Smad3 signaling protects against renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction［J］.Clin Invest,2003,112(10):1486-1494.期刊论文发表