羊肚菌多糖提取分离条件的研究
【摘要】 目的 研究羊肚菌多糖提取的最佳方法,并比较不同种羊肚菌在多糖得率上的区别。方法 以羊肚菌GIM5.69[(Morchella esculenta(L.)Pers.)]及黑脉羊肚菌GIM5.29(Morchella elata)的菌丝体作为实验对象,研究与常规热水浸提方法相比,超声及酶处理对多糖得率的不同影响,并比较两类羊肚菌在多糖得率上的区别。结果 超声和酶法均可显著提高多糖得率,其中以超声10 min提高效果最明显。不同类型的菌种在多糖产量上存在明显差异,GIM5.69型菌种多糖得率明显高于GIM5.29型。结论 羊肚菌多糖最佳提取分离条件为：超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下恒温加热150 min,浸提2次。
学术论文发表
【关键词】 羊肚菌；黑脉羊肚菌；多糖；提取工艺
Abstract：Objective To optimize the extraction technology of Morchella polysaccharide. Methods With GIM5.69 (Morchella esculenta (L.) Pers.) and GIM5.29 (Morchella elata) as the research object, the difference of polysaccharide yield with lixiviation in polysaccharide extraction between ultrasound and enzyme was observed. At the same time, the difference of polysaccharides yield of these two Morchella was compared. Result Ultrasound and enzyme both can improve the polysaccharides yield, and the effect of 10 min of ultrasound was the best. The polysaccharides yield of GIM5.69 was higher than that of GIM5.29, which means different strain has different polysaccharides yield. Conclusion The best extraction condition is 10 min of ultrasound at the frequency of 40 kHz, heating 150 min at 90 ℃ and lixiviation twice.
Key words：Morchella esculenta；Morchella elata；polysaccharides；extraction technology
羊肚菌又名羊肚菜、美味羊肚菌,隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科 (Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella),共有28种,在我国陕西、甘肃、青海等20多个省市都有着极为广泛的分布[1]，且在世界多个国家有分布。羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分之一,具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。有研究表明,羊肚菌多糖对小鼠肝脏损伤有明显的保护作用[2]。由此,提高羊肚菌多糖的提取率也是将其应用于工业生产的关键步骤。常规的羊肚菌多糖提取方法以热水浸提为主,贾氏等[3]研究发现,羊肚菌菌丝体多糖最佳的提取条件为：浸提温度90 ℃,浸提时间150 min,浸提次数2次,加水比1∶40。鉴于单纯热水浸提多糖的提取量有限,笔者在前人研究基础上进行了改进,研究超声及其酶法对多糖得率的影响,为工业生产提供必要的研究基础。
1 材料与方法
1.1 试药与仪器
供试菌种羊肚菌GIM5.69[(Morchella esculenta (L.) Pers.)]及黑脉羊肚菌GIM5.29(Morchella elata),广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供,标准葡聚糖Dextran T70为Pharmacia 公司产品,其余试剂均为国产分析纯。Labofuge 400R台式冷冻离心机(德国Heraeus),恒温培养箱(上海智城),RE-52旋转蒸发仪(上海青浦沪西),BP211D电子天平(德国Sartorius),MLS- 3750灭菌器(日本Sanyo)。
1.2 培养基及培养方法学术论文发表
斜面培养基：采用PDA培养基,含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%,无菌接种后25 ℃培养7～10 d,4 ℃保存。
液体种子培养基：含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后从斜面培养基上接种,25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
发酵培养基：含蔗糖4%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.15%、酵母膏0.5%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后按2%接种量吸取摇床培养的种子培养液接种,25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
1.3 多糖提取
经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取,本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取,并将结果与常规热水浸提加以比较,以获得优化多糖提取方式。
1.3.1 热水浸提
称取5 g干菌丝体,粉碎后加入40倍体积的去离子水,90 ℃,150 min,残渣重复浸提2次。合并上清液,过滤。在37 ℃条件下,上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMW3500透析袋透析2 d。透析液加3倍95%乙醇沉淀48 h后离心(3 500 r/min,20 min,4 ℃),弃去上清液,收集沉淀,以少量去离子水溶解,真空冷冻干燥得羊肚菌菌丝体粗多糖。
1.3.2 超声提取
称取5 g干菌丝体3份,粉碎后加入40倍体积的去离子水,分别按5、10、15 min 3个水平进行超声波处理,超声频率为40 kHz。然后按热水浸提方式提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
1.3.3 酶法提取
经正交试验[4]确定,对于果胶酶和纤维素酶而言,酶量的极差最大,是影响多糖提取率的关键因子,其次是酶处理的时间,温度的影响最小,酶处理的最佳条件是酶加量15%、50 ℃、3 h。故试验中称取5 g干菌丝体粉碎,加入20倍体积水,加入0.15 g酶,酶解3 h,酶解后加入20倍体积的水,热水浸提提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
1.4 多糖得率比较及多糖含量测定
称取不同提取方法所获得的粗多糖,比较其重量。同时鉴于粗多糖中可能含有一定杂质,对试验结果有影响,进一步对粗多糖中多糖含量进行检测并加以比较。配制标准葡聚糖(Dextran)T70(40 μg/mL),分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,各以去离子水补至2.0 mL。再加入6%苯酚1.0 mL以及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀,室温放置10 min后,测吸光值(A490),绘制标准曲线。同时将试验所获粗多糖以去离子水定容至100 mL,取样品1 mL,苯酚-硫酸法检测A490,同时对照标准曲线计算多糖含量。学术论文发表
1.5 多糖理化性质测定
检测粗多糖在水、乙醇、丙酮等有机溶剂中的溶解性。斐林试剂反应；Molish反应；FeCl3反应；(CTAB)络合反应[5]；硫酸-咔唑反应；I2-KI反应；同时在190～390 nm波长范围内对羊肚菌多糖进行扫描。
2 结果
2.1 粗多糖重量比较
(见表1)表1 粗多糖重量比较（略）
从粗多糖重量比较上分析,与单纯热水浸提相比,超声及酶法均可明显提高粗多糖得率。
2.2 苯酚-硫酸法检测多糖含量及制作标准曲线
根据苯酚-硫酸法检测结果制作标准曲线,多糖含量与吸光度A490之间的关系满足方程Y＝0.007 1X－0.045 5,其中X为A490,Y为溶液中多糖含量。
2.3 粗多糖中总糖含量检测
测得羊肚菌多糖的A490值,对照标准曲线方程Y＝0.007 1X－0.045 5计算所得的总糖含量。结果见表2、表3。表2 黑脉羊肚菌GIM5.29的多糖得率（略）表3 羊肚菌GIM5.69的多糖得率（略）
在以往对多糖提取方法的优化研究中,通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣,如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为 2.58%。该衡量标准较直观快捷,但因粗多糖中仍存在一定杂质,故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量,从糖得率上看数值较低,但结果更为精确。试验结果表明,超声和酶法处理均可显著提高多糖得率,且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下,恒温加热150 min,浸提2次,多糖的得率最高。两种菌种之中,以GIM5.69型菌种多糖得率较高。
2.4 多糖性质测定学术论文发表
羊肚菌多糖溶于水,不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色,说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性,说明不含单糖和多酚类物质；Molish反应为阳性,说明是典型的糖类物质；CTAB反应和硫酸-咔唑反应阳性,说明含有糖醛酸。对羊肚菌多糖在 190～390 nm扫描发现,其对核酸(260 nm)和蛋白质(280 nm)无明显吸收峰[7],可知该多糖样品中不含游离核酸及蛋白等杂质。
3 讨论
对于两类羊肚菌胞外多糖提取试验发现,相对于传统的单纯以热水浸提的方式,超声处理和纤维素酶、果胶酶处理提取均可明显增加多糖提取量,其中以超声处理方式对多糖提取量增加更为明显。超声处理主要是利用超声波空化产生的极大压力造成羊肚菌细胞壁及整个生物体破裂,且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解,加速菌丝体中多糖的溶出,故而能很好地提高多糖的得率。同时超声处理具有高效、节能、省时的特点,在工业生产中有较大利用价值。在超声时间的比较中,超声处理10 min对多糖得率的增加最为显著,这可能是因为长时间的超声波放射促使了羊肚菌多糖的分解,从而降低了提取率,这在以往的报道中同样存在先例：一种具有 β-1,3-D-葡萄糖结构的多糖在经过长时间的超声处理后,分子量从25万降至5万左右[8]。
同时,在对两类羊肚菌多糖的比较中发现,GIM5.69型羊肚菌多糖的提取率明显高于GIM5.29型羊肚菌,显示不同类型的羊肚菌在多糖产量上存在明显差异,这一结果对工业应用也有一定指导意义。
【参考文献】
[1] 宗 凯,杜 光.食(药)用羊肚菌研究现状[J].中国药师,2006,9(5)：460－462.
[2] 孙玉军,陈 彦,周正义,等.羊肚菌胞内多糖对小鼠急性肝损伤的影响[J].中国食用菌,2008,27(2)：41－41,45.
[3] 贾建会,吕晓莲,樊利青,等.深层发酵羊肚菌多糖的提取、分离及纯化研究[J].食品科学,2002,23(4)：59－63.
[4] 李 洁,邱德江.酶法提取羊肚菌多糖的研究简报[J].河北林业科技, 2005,2(1)：29－32.学术论文发表
[5] 孔庆胜,蒋 滞.南瓜多糖的组成及摩尔比测定[J].中国现代应用药学杂志,2000,17(2)：138－140.
[6] 武秋立,安家彦.羊肚菌多糖提取、分离条件的选择[J].食品科学,2005, 26(1)：116－120.
[7] 吴 彦,周守标,万 安.石蒜属植物多糖的分离纯化[J].生物学杂志, 2005,22(3)：44－45.
[8] Stahmann KP, Monschau N, Sahm H, et al. Structure properties of native and sonicated cinerean, aβ-(1-3)-(1-6)-D-glucan produced by Botrytiscinerea[J]. Carbohydr Res,1995,226(1)：115－128.
学术论文发表
【关键词】 羊肚菌；黑脉羊肚菌；多糖；提取工艺
Abstract：Objective To optimize the extraction technology of Morchella polysaccharide. Methods With GIM5.69 (Morchella esculenta (L.) Pers.) and GIM5.29 (Morchella elata) as the research object, the difference of polysaccharide yield with lixiviation in polysaccharide extraction between ultrasound and enzyme was observed. At the same time, the difference of polysaccharides yield of these two Morchella was compared. Result Ultrasound and enzyme both can improve the polysaccharides yield, and the effect of 10 min of ultrasound was the best. The polysaccharides yield of GIM5.69 was higher than that of GIM5.29, which means different strain has different polysaccharides yield. Conclusion The best extraction condition is 10 min of ultrasound at the frequency of 40 kHz, heating 150 min at 90 ℃ and lixiviation twice.
Key words：Morchella esculenta；Morchella elata；polysaccharides；extraction technology
羊肚菌又名羊肚菜、美味羊肚菌,隶属于子囊菌亚门(Ascomycotina)盘菌纲(Discomycetes)盘菌目(Pezizales)羊肚菌科 (Morchellaceae)羊肚菌属(Morchella),共有28种,在我国陕西、甘肃、青海等20多个省市都有着极为广泛的分布[1]，且在世界多个国家有分布。羊肚菌多糖是羊肚菌主要的活性成分之一,具有抗肿瘤、抗菌、抗疲劳、增强免疫力等多种药理活性。有研究表明,羊肚菌多糖对小鼠肝脏损伤有明显的保护作用[2]。由此,提高羊肚菌多糖的提取率也是将其应用于工业生产的关键步骤。常规的羊肚菌多糖提取方法以热水浸提为主,贾氏等[3]研究发现,羊肚菌菌丝体多糖最佳的提取条件为：浸提温度90 ℃,浸提时间150 min,浸提次数2次,加水比1∶40。鉴于单纯热水浸提多糖的提取量有限,笔者在前人研究基础上进行了改进,研究超声及其酶法对多糖得率的影响,为工业生产提供必要的研究基础。
1 材料与方法
1.1 试药与仪器
供试菌种羊肚菌GIM5.69[(Morchella esculenta (L.) Pers.)]及黑脉羊肚菌GIM5.29(Morchella elata),广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供,标准葡聚糖Dextran T70为Pharmacia 公司产品,其余试剂均为国产分析纯。Labofuge 400R台式冷冻离心机(德国Heraeus),恒温培养箱(上海智城),RE-52旋转蒸发仪(上海青浦沪西),BP211D电子天平(德国Sartorius),MLS- 3750灭菌器(日本Sanyo)。
1.2 培养基及培养方法学术论文发表
斜面培养基：采用PDA培养基,含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%,无菌接种后25 ℃培养7～10 d,4 ℃保存。
液体种子培养基：含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后从斜面培养基上接种,25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
发酵培养基：含蔗糖4%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.15%、酵母膏0.5%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中,灭菌后按2%接种量吸取摇床培养的种子培养液接种,25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
1.3 多糖提取
经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取,本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取,并将结果与常规热水浸提加以比较,以获得优化多糖提取方式。
1.3.1 热水浸提
称取5 g干菌丝体,粉碎后加入40倍体积的去离子水,90 ℃,150 min,残渣重复浸提2次。合并上清液,过滤。在37 ℃条件下,上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMW3500透析袋透析2 d。透析液加3倍95%乙醇沉淀48 h后离心(3 500 r/min,20 min,4 ℃),弃去上清液,收集沉淀,以少量去离子水溶解,真空冷冻干燥得羊肚菌菌丝体粗多糖。
1.3.2 超声提取
称取5 g干菌丝体3份,粉碎后加入40倍体积的去离子水,分别按5、10、15 min 3个水平进行超声波处理,超声频率为40 kHz。然后按热水浸提方式提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
1.3.3 酶法提取
经正交试验[4]确定,对于果胶酶和纤维素酶而言,酶量的极差最大,是影响多糖提取率的关键因子,其次是酶处理的时间,温度的影响最小,酶处理的最佳条件是酶加量15%、50 ℃、3 h。故试验中称取5 g干菌丝体粉碎,加入20倍体积水,加入0.15 g酶,酶解3 h,酶解后加入20倍体积的水,热水浸提提取羊肚菌粗多糖,方法同前。
1.4 多糖得率比较及多糖含量测定
称取不同提取方法所获得的粗多糖,比较其重量。同时鉴于粗多糖中可能含有一定杂质,对试验结果有影响,进一步对粗多糖中多糖含量进行检测并加以比较。配制标准葡聚糖(Dextran)T70(40 μg/mL),分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,各以去离子水补至2.0 mL。再加入6%苯酚1.0 mL以及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀,室温放置10 min后,测吸光值(A490),绘制标准曲线。同时将试验所获粗多糖以去离子水定容至100 mL,取样品1 mL,苯酚-硫酸法检测A490,同时对照标准曲线计算多糖含量。学术论文发表
1.5 多糖理化性质测定
检测粗多糖在水、乙醇、丙酮等有机溶剂中的溶解性。斐林试剂反应；Molish反应；FeCl3反应；(CTAB)络合反应[5]；硫酸-咔唑反应；I2-KI反应；同时在190～390 nm波长范围内对羊肚菌多糖进行扫描。
2 结果
2.1 粗多糖重量比较
(见表1)表1 粗多糖重量比较（略）
从粗多糖重量比较上分析,与单纯热水浸提相比,超声及酶法均可明显提高粗多糖得率。
2.2 苯酚-硫酸法检测多糖含量及制作标准曲线
根据苯酚-硫酸法检测结果制作标准曲线,多糖含量与吸光度A490之间的关系满足方程Y＝0.007 1X－0.045 5,其中X为A490,Y为溶液中多糖含量。
2.3 粗多糖中总糖含量检测
测得羊肚菌多糖的A490值,对照标准曲线方程Y＝0.007 1X－0.045 5计算所得的总糖含量。结果见表2、表3。表2 黑脉羊肚菌GIM5.29的多糖得率（略）表3 羊肚菌GIM5.69的多糖得率（略）
在以往对多糖提取方法的优化研究中,通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣,如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为 2.58%。该衡量标准较直观快捷,但因粗多糖中仍存在一定杂质,故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量,从糖得率上看数值较低,但结果更为精确。试验结果表明,超声和酶法处理均可显著提高多糖得率,且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下,恒温加热150 min,浸提2次,多糖的得率最高。两种菌种之中,以GIM5.69型菌种多糖得率较高。
2.4 多糖性质测定学术论文发表
羊肚菌多糖溶于水,不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色,说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性,说明不含单糖和多酚类物质；Molish反应为阳性,说明是典型的糖类物质；CTAB反应和硫酸-咔唑反应阳性,说明含有糖醛酸。对羊肚菌多糖在 190～390 nm扫描发现,其对核酸(260 nm)和蛋白质(280 nm)无明显吸收峰[7],可知该多糖样品中不含游离核酸及蛋白等杂质。
3 讨论
对于两类羊肚菌胞外多糖提取试验发现,相对于传统的单纯以热水浸提的方式,超声处理和纤维素酶、果胶酶处理提取均可明显增加多糖提取量,其中以超声处理方式对多糖提取量增加更为明显。超声处理主要是利用超声波空化产生的极大压力造成羊肚菌细胞壁及整个生物体破裂,且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解,加速菌丝体中多糖的溶出,故而能很好地提高多糖的得率。同时超声处理具有高效、节能、省时的特点,在工业生产中有较大利用价值。在超声时间的比较中,超声处理10 min对多糖得率的增加最为显著,这可能是因为长时间的超声波放射促使了羊肚菌多糖的分解,从而降低了提取率,这在以往的报道中同样存在先例：一种具有 β-1,3-D-葡萄糖结构的多糖在经过长时间的超声处理后,分子量从25万降至5万左右[8]。
同时,在对两类羊肚菌多糖的比较中发现,GIM5.69型羊肚菌多糖的提取率明显高于GIM5.29型羊肚菌,显示不同类型的羊肚菌在多糖产量上存在明显差异,这一结果对工业应用也有一定指导意义。
【参考文献】
[1] 宗 凯,杜 光.食(药)用羊肚菌研究现状[J].中国药师,2006,9(5)：460－462.
[2] 孙玉军,陈 彦,周正义,等.羊肚菌胞内多糖对小鼠急性肝损伤的影响[J].中国食用菌,2008,27(2)：41－41,45.
[3] 贾建会,吕晓莲,樊利青,等.深层发酵羊肚菌多糖的提取、分离及纯化研究[J].食品科学,2002,23(4)：59－63.
[4] 李 洁,邱德江.酶法提取羊肚菌多糖的研究简报[J].河北林业科技, 2005,2(1)：29－32.学术论文发表
[5] 孔庆胜,蒋 滞.南瓜多糖的组成及摩尔比测定[J].中国现代应用药学杂志,2000,17(2)：138－140.
[6] 武秋立,安家彦.羊肚菌多糖提取、分离条件的选择[J].食品科学,2005, 26(1)：116－120.
[7] 吴 彦,周守标,万 安.石蒜属植物多糖的分离纯化[J].生物学杂志, 2005,22(3)：44－45.
[8] Stahmann KP, Monschau N, Sahm H, et al. Structure properties of native and sonicated cinerean, aβ-(1-3)-(1-6)-D-glucan produced by Botrytiscinerea[J]. Carbohydr Res,1995,226(1)：115－128.
