西安地区肠杆菌科细菌的超广谱β-内酰胺酶基因型的研究

【摘要】  目的 测定西安地区肠杆菌科细菌中的超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBL)的基因型。方法 在西安市的5所医院中随机选取产ESBL的肠杆菌科细菌25株(共125株)，采用PCR方法特异性扩增TEM、SHV和CTX-M型酶的基因片段。结果 在125株产ESBL菌中，有33株扩增出TEM型酶基因片段；有27株扩增出特异性SHV型酶基因片段；有49株扩增出特异性的CTX-M型酶基因片段；共有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。结论 在西安地区的ESBL肠杆菌科细菌中CTX-M型酶较为流行。教育教学论文发表

【关键词】  肠杆菌科细菌；超广谱β-内酰胺酶；基因型

　　ABSTRACT: Objective  To study the genotypes of ESBL-producing Enterobacteriaceae in Xi’an city. Methods  Totally 125 ESBL-producing nterobacteriaceae strains were randomly selected from five hospitals of Xi’an City, and TEM-type, SHV-type and CTX-M-type ESBL genes were amplified by PCR. Results  Among the 125 ESBL-producing Enterobacteriaceae strains, TEM-type ESBL genes were amplified from 33 strains, SHV-type ESBL genes were amplified from 26 strains, CTX-M-type ESBL genes were amplified from 49 strains, and two or more type ESBL genes were amplified from 22 strains. Conclusion  CTX-M-type ESBL are prevalent in ESBL-producing Enterbacteriaceae in Xi’an City.

　　KEY WORDS: enterobacteriaceae; extended-spectrum β-lactamases; genotype教育教学论文发表

　　产生超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBL)是肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素耐药的最主要机制。肠杆菌科细菌特别是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是产生ESBL的最主要细菌［1］。为了解西安市产ESBL肠杆菌科细菌中ESBL基因型的流行情况，我们对2002年9月至2003年8月西安市5所三甲医院分离到的部分产ESBL肠杆菌科细菌进行了基因型的测定。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验的菌株
 
　　2002年9月至2003年8月从西安交通大学医学院第二附属医院、第四军医大学唐都医院、陕西省人民医院、西安市中心医院、西安市儿童医院5所医院的细菌室分离出非重复肠杆菌科细菌1 518株，经表型筛选和确证试验，共检出产ESBL菌株283株［2］。对每所医院的产ESBL菌株按分离的先后顺序进行编号，以随机数字法在每所医院随机选择25株菌株进行研究。细菌的鉴定由各医院细菌室独立进行，使用全自动化微生物鉴定仪Vitek60或Vitek32完成。教育教学论文发表

　　1.2  模板的制备
 
　　取单个菌落接种于5 mL LB肉汤中，于37 ℃振荡培养20 h。取1.5 mL菌悬液在4 ℃ 13 000 r/min条件下离心5 min，弃上清。在室温下使细菌沉淀干燥5 min，加入500 μL的无菌去离子水，振荡混悬。在95 ℃水浴中加热10 min后，4 ℃ 13 000 r/min离心5 min除去细胞碎片，将上清移入另一离心管中，此上清即为制备的模板DNA。

　　1.3  引物的设计

　　在美国国家生物技术信息中心上查找各型ESBL的基因序列，使用引物设计软件Primer 3设计引物(表1)。引物由上海生工生物技术有限公司合成。表1  PCR反应所用的引物（略）

　　1.4  PCR

　　PCR在DNA热循环仪(DNA Thermal Cycler 480)上进行。三型酶的扩增条件相同。反应总体积为50 μL，其中10×Buffer为5 μL；dNTP混合物，各组分均为0.2 mmol/L；Taq酶2u；左右侧引物各0.5 μmol/L；氯化镁浓度为2.0 mol/L；模板2 μL。短暂离心混合物后，加入矿物油30 μL。PCR循环条件为93 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环。在首个循环前于93 ℃预变性5 min。循环结束后，于72 ℃再延伸10 min。整个反应结束后，将PCR仪置于4 ℃环境中。教育教学论文发表

　　1.5  琼脂糖电泳

　　在含溴化乙锭(浓度为0.5 μmol/L)的琼脂糖凝胶中电泳分离PCR反应产物。电泳缓冲液为0.5×TBE Buffer，电泳后紫外灯下观察结果。

　　1.6  质量控制
 
　　SHV型酶的基因测定选用肺炎克雷伯菌ATCC700603为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照，TEM型酶以及CTX-M型酶基因测定选用肺炎克雷伯菌ATCC700603为阴性对照。

　　2  结果

　　2.1  细菌分布

　　在测定的125株细菌中大肠埃希菌52株，肺炎/产酸克雷伯菌47株，阴沟肠杆菌9株，产气肠杆菌7株，其他肠杆菌科细菌10株。
2.2  TEM型酶基因的扩增结果

　　125株细菌中，有33株细菌扩增出特异性TEM型酶基因片段，其中有大肠埃希菌23株，肺炎克雷伯菌5株，产酸克雷伯菌1株，阴沟肠杆菌2株，产气肠杆菌2株。肺炎克雷伯菌ATCC700603中未扩增到特异的TEM酶基因片段(图1)。教育教学论文发表

　　2.3  SHV型酶基因的扩增结果

　　125株细菌中，有27株菌扩增出特异性SHV型酶基因片段，其中肺炎克雷伯菌13株，产酸克雷伯菌8株，大肠埃希菌5株，阴沟肠杆菌1株。肺炎克雷伯菌ATCC700603扩增出特异性SHV型酶基因片段，而大肠埃希菌ATCC25922未扩增出特异性基因片段(图2)。

　　2.4  CTX-M型酶基因的扩增结果
　
　　125株细菌中，有49株菌扩增出特异性CTX-M型酶基因片段，其中大肠埃希菌29株，肺炎克雷伯菌6株，产酸克雷伯菌5株，阴沟肠杆菌4株，产气肠杆菌2株，弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺菌和普通变形杆菌各1株。在肺炎克雷伯菌 ATCC700603中未扩增到特异的CTX-M型酶基因片段(图3)。

　　2.5  同时扩增出两种基因的细菌

　　在125株细菌中，有1株大肠埃希菌同时扩增出TEM、SHV和CTX-M三型酶基因片段；同时扩增出TEM和SHV酶基因片段的细菌有5株，其中大肠埃希菌2株，肺炎克雷伯菌2株，阴沟肠杆菌1株；同时扩增出SHV和CTX-M酶基因片段的细菌有6株，其中大肠埃希菌2株，阴沟肠杆菌4株；同时扩增出TEM和CTX-M型酶基因片段的细菌共10株，其中大肠埃希菌8株，肺炎克雷伯菌1株，产气肠杆菌1株。教育教学论文发表

　　3  讨 论
  
　　文献报道，ESBL是细菌产生的能水解大多数青霉素、头孢菌素和氨曲南等β-内酰胺类抗生素且活性能被酶抑制剂(如克拉维酸、舒巴坦)抑制的一类β-内酰胺酶［3］。它是一种丝氨酸蛋白酶，属于分子分型的A型酶，功能分型的2be型酶。根据ESBL基因和蛋白质氨基酸序列的同源性将其分为四类：TEM型、 SHV型、CTX-M型、其他型。
    　
　　在125株ESBL阳性菌株中，有33株扩增出特异性的TEM酶基因片段，检出率为 26.40%。在产ESBL大肠埃希菌中，其检出率为44.23%(23/52)，而在克雷伯菌属中检出率仅为12.76%(6/47)。这说明在西安地区TEM型酶主要在大肠埃希菌中流行。这与国内外文献报道的结果一致［3-4］。
  
　　在125株ESBL阳性菌株中，有27株菌扩增出特异性SHV型酶基因片段。SHV型酶检出率为21.60%。在27株产SHV酶细菌中肺炎/产酸克雷伯菌21株，大肠埃希菌5株，阴沟肠杆菌1 株。产ESBL肺炎/产酸克雷伯菌中，SHV型酶检出率为44.68%，而在产ESBL大肠埃希菌中，检出率仅为9.62%。因此，在西安市产ESBL克雷伯菌属中，SHV酶比较流行，与文献报道的广州和台湾情况相同［5-6］。这种情况可能与SHV-1在肺炎克雷伯菌中广泛存在有关［3］。
 
　　在125株ESBL阳性菌株中，有49株菌扩增出特异性CTX-M型酶基因片段。CTX-M型酶的检出率为39.20%。因此，在西安地区产ESBL菌中，CTX-M型酶较为流行。这可能与本地区大量使用头孢噻肟和头孢曲松有一定的关系。产ESBL肺炎/产酸克雷伯菌中，CTX-M型酶检出率为 23.40%，而在产ESBL大肠埃希菌中，检出率仅为55.77%。此结果与文献报道的亚洲地区CTX-M型ESBL比较流行相符［6-7］，而且关于此型酶的流行国内其他地区报道也比较多［5,8］。教育教学论文发表
  
　　在我们研究的125株细菌中，有22株细菌同时扩增出两种以上的酶基因片段。这与文献报道的多数产ESBL菌株同时携带2种以上β-内酰胺酶的结果相符［4-9］。另外，尚有38株细菌既没有扩增出SHV型酶基因，也没有扩增出CTX-M及TEM型酶基因。它们可能产生的是其他型ESBL。经过PCR只能对细菌产哪一型酶进行分析，并不能明确细菌产生的是哪一个酶。若要明确这一问题，还需对扩增产物纯化后进行碱基序列的分析。

【参考文献】
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　　［2］刘原，徐灵彬，耿燕，等. 肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶的流行病学特征研究 ［J］.中华医院感染学杂志, 2007, 17(8):910-913.

　　［3］Bradford PA. Extended-spectrum β-lactamases in the 21st century: characterization, epidemionlogy, and detection of this important resistance threat ［J］. Clin Micro Rev, 2001, 14(4):933-951.

　　［4］陈茶，黄彬，张文. 产ESBLs大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的基因分型研究 ［J］. 广东医学，2006, 27(5):686-687.

　　［5］Zuo B, Liu ZH, Wang HP, et al. Genotype of TEM- and SHV-type beta-lactamase producing Klebsiella pneumoniae in Guangzhou area ［J］. Zhonghua Yixue Zazhi, 2006, 86(41):2928-2932.

　　［6］Wu TL, Chia JH, Su LH, et al. Dissemination of extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae in intensive care units of a medical center in Taiwan ［J］. Microb Drug Resist, 2006, 12(3):203-209.

　　［7］Ensor VM, Shahid M, Evans JT, et al. Occurrence, prevalence and genetic environment of CTX-M beta-lactamases in Enterobacteriaceae from Indian hospitals ［J］. J Antimicrob Chemother, 2006, 58(6):1260-1263.

　　［8］杨启文，徐英春，王辉，等. CTX-M酶在北京协和医院临床分离大肠埃希菌中的流行 ［J］.中国感染与化疗杂志, 2006, 6(1):1-6.

　　［9］Lal P, Kapil A, Das BK, et al. Occurrence of TEM & SHV gene in extended spectrum beta-lactamases (ESBLs) producing Klebsiella sp. isolated from a tertiary care hospital ［J］. Indian J Med Res, 2007, 125 (2):173-178.

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