中药对抗再生障碍性贫血骨髓细胞凋亡的研究现状
【关键词】 再生障碍性贫血；细胞凋亡；中医药疗法；综述
再生障碍性贫血(下简称“再障”)的发生与免疫系统紊乱密切相关,其中T淋巴细胞在其免疫发病机制中具有重要作用。骨髓造血功能衰竭主要与活化的细胞毒性T细胞(CTL)有关,T细胞亚群和活化T细胞的变化,造成细胞因子的分泌失衡,可产生大量的造血负调控细胞因子,同时激活细胞凋亡系统,从而引起骨髓造血衰竭。大多数再障对免疫抑制剂治疗有效,临床观察及实验研究均支持再障的免疫发病机制。因此,纠正免疫功能的紊乱,对抗造血干、祖细胞的凋亡,保护其增殖分化功能,是治疗再障的基本原则。由11个氨基酸残基组成的一种环形多肽环孢菌素A(CsA)是一种特异性较高的免疫抑制剂,是治疗再障的有效药物[1-3],但有效率约为50%。鉴于临床上部分再障患者对CsA治疗无效,因此迫切需要寻找治疗再障的其它药物[4]。目前,中药治疗再障的研究在对抗再障患者骨髓细胞凋亡方面取得了可喜的进展,现综述如下。
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1 细胞凋亡与再障相关性简述
细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序性的死亡[5]。凋亡的发生是基因的表达、蛋白质的合成和细胞内Ca2+浓度的增高等多种自主性生物行为,有不同的信号传导系统介导和参与,是由很多膜受体及胞浆蛋白参加的一系列分子事件导致的一种细胞主动自杀过程。大致过程是细胞整合各种胞内外凋亡信号,通过细胞凋亡信号与其受体形成的复合物经胞浆信号蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspases,在由激活的caspases对其特异性底物进行降解,最终导致细胞凋亡。在整个细胞凋亡过程中,信号传递、中央调控和结构改变是其发生和发展的三大阶段,其中信号传递是凋亡发生的关键。它是指内源或外源信号经胞膜、胞浆传至胞核引起基因及蛋白变化的过程。细胞凋亡信号传导途径大致有3条：①通过Fas(CD95)及其配体(FasL)启动上游再活化下游导致细胞凋亡；②通过线粒体途径。致凋亡因素作用于线粒体,使其膜电位改变,从而功能发生变化导致细胞凋亡；③既有Fas/FasL又有线粒体共同参与,二者在多个位点上相互交织、互为结果,使凋亡效应实现自我放大[6]。可见,在凋亡的细胞传导过程中Fas/FasL系统起着非常重要的作用。
再障患者T淋巴细胞处于激活状态,同时分泌功能失调,产生过量的造血负调控因子,从而表现出明显的造血抑制活性。正常情况下,激活的T淋巴细胞可在多种情况下发生凋亡,但有一种特殊的凋亡形式,称为激活诱导的细胞死亡(activation induced cell death,AICD),即当T淋巴细胞的表面分子TCR/CD3被激活后,若其再次受到刺激时,便可发生AICD。AICD主要通过Fas抗原与其配体FasL参与免疫反应过程中淋巴细胞数量的调控[7],淋巴细胞被抗原激活后也开始表达FasL,而Fas在成熟T淋巴细胞中就有基础表达,在激活的T淋巴细胞中表达增加。Fas和FasL的同时表达使激活的T淋巴细胞在其发挥功能后立即凋亡,从而避免对机体的损伤。然而,再障患者处于激活的T淋巴细胞Fas表达明显下降,致使激活后的T淋巴细胞不能立即凋亡,导致对机体正常造血细胞的损伤。同时研究亦证实,再障患者骨髓CD＋ 34细胞表面Fas表达过度,与再障患者活化的T淋巴细胞中高表达的FasL结合,从而启动CD＋ 34细胞凋亡,引起造血衰竭。
2 实验研究
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2.1 甘草酸
甘草酸是甘草的主要成分, 分子结构中含1分子甘草次酸和2分子葡萄糖醛酸。由于甘草酸在结构上与糖皮质激素相似,在体内可延缓皮质激素的代谢,且对下丘脑-垂体-肾上腺轴无明显影响,故作为皮质激素的替代治疗,目前已用于自身免疫疾病的治疗。体外研究表明, 甘草酸可显著抑制抗原对T细胞的过度激活作用及由TNF-α介导的细胞毒作用, 从而调节免疫反应；调节T细胞释放细胞因子,使Th1/Th2保持平衡。
研究表明,甘草酸可阻止Fas抗体介导的细胞凋亡,而再障的发病机制与Fas介导的造血干细胞凋亡有关[8-13]。因此,为甘草酸应用于再障的实验研究提供了思路。任氏等[14]通过免疫诱导小鼠产生再障模型,再采用不同剂量甘草酸治疗,观察甘草酸对免疫诱导再障小鼠骨髓造血功能的影响,结果表明,甘草酸可促进免疫诱导再障小鼠骨髓造血功能恢复,且具有剂量-效应关系。
2.2 三七皂苷
三七皂苷是中药三七的主要活性成分,能够刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化[15],改善再生障碍性贫血小鼠的骨髓抑制并促进造血细胞增殖等[16]。王氏等[17]报道,在体外通过诱导红系、粒系分泌造血调节因子,间接地促进血细胞生成；邹氏等[18]报道,可明显地对抗Coγ射线照射小鼠的实验性骨髓抑制。三七皂苷不但促进CD34+造血干细胞增殖,使CFU-Mix集落形成增加,而且能够诱导CD34+细胞向粒系细胞定向分化[19]。盖氏等[20]报道,还能够改善免疫介导性再障小鼠骨髓的抑制,升高外周血白细胞。
陈氏等[21]用三七皂苷处理粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01共4种细胞株后,提取胞浆蛋白和核蛋白,观察Daxx、Fas、NF-kb和c-Rel蛋白的表达水平,结果发现,三七皂苷某种程度上能够通过抑制Daxx、Fas蛋白表达,而相应减少细胞凋亡；同时也能通过增加NF-κB和c-Rel蛋白表达促进细胞增殖,并阻止半胱天冬酶连锁链的活化而抑制造血细胞凋亡,为应用于临床治疗凋亡过度的疾病(如再障)提供了可能性。
2.3 中药复方
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何氏等[22]研究扶正养营颗粒对免疫介导再障小鼠的作用机制,检测各组小鼠造血细胞凋亡以及相关调控蛋白Fas与Caspase-3的表达。研究表明,扶正养营颗粒能下调造血细胞表面基因蛋白Fas,并可抑制细胞凋亡过程中激活的关键激酶Caspase-3的活性,从而减少骨髓造血细胞凋亡的发生,改善骨髓造血功能,起到治疗慢性再障的作用。
刘氏等[23]观察炙甘草汤对再障模型小鼠骨髓造血细胞Caspease-3和人抗增殖细胞核抗原Ki-67的影响。结果发现,经炙甘草汤治疗的再障小鼠比模型组的再障小鼠Caspease-3明显降低,Ki-67表达明显升高,但各项指标在阳性对照药物康力龙的治疗组中无明显差别。说明炙甘草汤对再障小鼠造血细胞具有明显的保护和修复作用,对抑制细胞凋亡和促进细胞增生也有一定的作用。
3 临床研究
毕氏等[24]用补肾活血通络为主的愈障口服液治疗儿童慢性再障,观察临床疗效及治疗前后骨髓CD34+细胞原位凋亡情况。研究结果表明,治疗组骨髓CD34+细胞的凋亡率较治疗前明显降低,与对照组治疗后比较,差异有非常显著性意义(P<0.0l)。其作用机制可能是通过调节机体免疫功能,改善骨髓微环境或直接作用于骨髓CD34+细胞,抑制促凋亡因素或增加抗凋亡因素,以达到对儿童CAA骨髓CD34+细胞的调节、控制,从而使CAA患儿的骨髓造血功能重建。
刘氏等[25]以补肾活血通络法治疗再障,检测治疗前后再障患者T淋巴细胞亚群及血浆sFas、sFasL水平。结果表明,治疗前2组患者CD8细胞明显高于正常值,CD4/CD8比值明显低于正常值,治疗后治疗组CD8的下降程度和CD4/CD8的比值升高程度均较对照组显著(P<0.05)；治疗前2组患者血浆sFas水平比健康组明显减低(P<0.01),经补肾活血通络法治疗后,治疗组sFas水平较治疗前及对照组均明显增高(P<0.01)。据此推测,补肾活血通络法治疗CAA的作用机制可能是通过调整机体免疫功能,升高sFas水平,进而与Fas分子竞争结合FasL,阻断Fas介导的细胞凋亡。
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孙氏等[26]用补髓生血颗粒治疗再障并检测治疗前后骨髓造血细胞凋亡阳性指数及Bax基因表达阳性指数,结果表明,慢性再障患者骨髓细胞凋亡阳性指数及Bax基因表达阳性指数明显高于正常组,说明慢性再障患者骨髓造血细胞确实存在过度凋亡现象。经补髓生血颗粒治疗2个疗程后,肾阳虚型和肾阴虚型的细胞凋亡阳性指数和Bax基因表达阳性指数均较疗前明显下降,其中肾阳虚型患者细胞凋亡阳性指数趋于正常,但Bax基因表达水平仍高于正常组；肾阴虚型患者细胞凋亡阳性指数仍高于正常组,Bax水平亦高于正常。补髓生血颗粒对慢性再障患者有抑制造血细胞凋亡和下调Bax基因表达水平的作用,但这两种作用并不平行,说明降低Bax基因表达水平只是其抑制造血细胞过度凋亡的机制之一,Bax基因表达水平在治疗后仍难以降至正常,这可能是慢性再障难以根治的原因之一。
唐氏等[27]用参麦注射液联合SSL方案治疗CCA总有效率为63.6%,较对照组明显提高(P<0.01)。CCA患者血清TNF-α浓度、骨髓CD34+细胞凋亡率明显较健康人高(P<0.01)。经参麦注射液联合SSL方案治疗后,CAA患者血清TNF-α浓度、骨髓CD34+细胞凋亡率明显降低,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。本研究表明,参麦注射液可能通过调节CAA患者免疫功能,抑制骨髓CD34+细胞凋亡来改善患者骨髓的造血功能,达到治疗慢性再障的作用。
4 小结
慢性再障属中医学“虚劳”、“血证”等范畴。1989年6月(大连),全国中西医结合血液病专业委员会第三届第二次学术会议拟定的肾阳虚、肾阴虚和肾阴阳两虚三型辨证标准,使再障的诊治水平产生飞跃,以补肾为主的方药治疗慢性再障已取得了较好的疗效[28-30]。中药治疗再障因其多靶点、多途径越来越受到学者们的关注。目前研究证实,中药可以改善骨髓造血微环境,促进骨髓造血,有改善再障患者免疫机制、对抗骨髓细胞凋亡等作用,同时可以减少西药的不良反应,提高患者整体状况。然而,研究多以补肾为主,中药复方为多,中药单体研究较之为少,多停留于检测骨髓CD34+细胞凋亡率,或者某种相关凋亡基因水平,中药对抗骨髓细胞凋亡的机制还尚不十分明确。从中药领域寻找治疗再障的特异性药物还需要一定时间,从临床治疗再障常用药物提取中药单体,以细胞凋亡路径为切入点,深入研究其作用机理,是今后研究的重点方向。
【参考文献】
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再生障碍性贫血(下简称“再障”)的发生与免疫系统紊乱密切相关,其中T淋巴细胞在其免疫发病机制中具有重要作用。骨髓造血功能衰竭主要与活化的细胞毒性T细胞(CTL)有关,T细胞亚群和活化T细胞的变化,造成细胞因子的分泌失衡,可产生大量的造血负调控细胞因子,同时激活细胞凋亡系统,从而引起骨髓造血衰竭。大多数再障对免疫抑制剂治疗有效,临床观察及实验研究均支持再障的免疫发病机制。因此,纠正免疫功能的紊乱,对抗造血干、祖细胞的凋亡,保护其增殖分化功能,是治疗再障的基本原则。由11个氨基酸残基组成的一种环形多肽环孢菌素A(CsA)是一种特异性较高的免疫抑制剂,是治疗再障的有效药物[1-3],但有效率约为50%。鉴于临床上部分再障患者对CsA治疗无效,因此迫切需要寻找治疗再障的其它药物[4]。目前,中药治疗再障的研究在对抗再障患者骨髓细胞凋亡方面取得了可喜的进展,现综述如下。
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1 细胞凋亡与再障相关性简述
细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序性的死亡[5]。凋亡的发生是基因的表达、蛋白质的合成和细胞内Ca2+浓度的增高等多种自主性生物行为,有不同的信号传导系统介导和参与,是由很多膜受体及胞浆蛋白参加的一系列分子事件导致的一种细胞主动自杀过程。大致过程是细胞整合各种胞内外凋亡信号,通过细胞凋亡信号与其受体形成的复合物经胞浆信号蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspases,在由激活的caspases对其特异性底物进行降解,最终导致细胞凋亡。在整个细胞凋亡过程中,信号传递、中央调控和结构改变是其发生和发展的三大阶段,其中信号传递是凋亡发生的关键。它是指内源或外源信号经胞膜、胞浆传至胞核引起基因及蛋白变化的过程。细胞凋亡信号传导途径大致有3条：①通过Fas(CD95)及其配体(FasL)启动上游再活化下游导致细胞凋亡；②通过线粒体途径。致凋亡因素作用于线粒体,使其膜电位改变,从而功能发生变化导致细胞凋亡；③既有Fas/FasL又有线粒体共同参与,二者在多个位点上相互交织、互为结果,使凋亡效应实现自我放大[6]。可见,在凋亡的细胞传导过程中Fas/FasL系统起着非常重要的作用。
再障患者T淋巴细胞处于激活状态,同时分泌功能失调,产生过量的造血负调控因子,从而表现出明显的造血抑制活性。正常情况下,激活的T淋巴细胞可在多种情况下发生凋亡,但有一种特殊的凋亡形式,称为激活诱导的细胞死亡(activation induced cell death,AICD),即当T淋巴细胞的表面分子TCR/CD3被激活后,若其再次受到刺激时,便可发生AICD。AICD主要通过Fas抗原与其配体FasL参与免疫反应过程中淋巴细胞数量的调控[7],淋巴细胞被抗原激活后也开始表达FasL,而Fas在成熟T淋巴细胞中就有基础表达,在激活的T淋巴细胞中表达增加。Fas和FasL的同时表达使激活的T淋巴细胞在其发挥功能后立即凋亡,从而避免对机体的损伤。然而,再障患者处于激活的T淋巴细胞Fas表达明显下降,致使激活后的T淋巴细胞不能立即凋亡,导致对机体正常造血细胞的损伤。同时研究亦证实,再障患者骨髓CD＋ 34细胞表面Fas表达过度,与再障患者活化的T淋巴细胞中高表达的FasL结合,从而启动CD＋ 34细胞凋亡,引起造血衰竭。
2 实验研究
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2.1 甘草酸
甘草酸是甘草的主要成分, 分子结构中含1分子甘草次酸和2分子葡萄糖醛酸。由于甘草酸在结构上与糖皮质激素相似,在体内可延缓皮质激素的代谢,且对下丘脑-垂体-肾上腺轴无明显影响,故作为皮质激素的替代治疗,目前已用于自身免疫疾病的治疗。体外研究表明, 甘草酸可显著抑制抗原对T细胞的过度激活作用及由TNF-α介导的细胞毒作用, 从而调节免疫反应；调节T细胞释放细胞因子,使Th1/Th2保持平衡。
研究表明,甘草酸可阻止Fas抗体介导的细胞凋亡,而再障的发病机制与Fas介导的造血干细胞凋亡有关[8-13]。因此,为甘草酸应用于再障的实验研究提供了思路。任氏等[14]通过免疫诱导小鼠产生再障模型,再采用不同剂量甘草酸治疗,观察甘草酸对免疫诱导再障小鼠骨髓造血功能的影响,结果表明,甘草酸可促进免疫诱导再障小鼠骨髓造血功能恢复,且具有剂量-效应关系。
2.2 三七皂苷
三七皂苷是中药三七的主要活性成分,能够刺激人骨髓红系、粒系造血祖细胞增殖和分化[15],改善再生障碍性贫血小鼠的骨髓抑制并促进造血细胞增殖等[16]。王氏等[17]报道,在体外通过诱导红系、粒系分泌造血调节因子,间接地促进血细胞生成；邹氏等[18]报道,可明显地对抗Coγ射线照射小鼠的实验性骨髓抑制。三七皂苷不但促进CD34+造血干细胞增殖,使CFU-Mix集落形成增加,而且能够诱导CD34+细胞向粒系细胞定向分化[19]。盖氏等[20]报道,还能够改善免疫介导性再障小鼠骨髓的抑制,升高外周血白细胞。
陈氏等[21]用三七皂苷处理粒系HL-60、红系K562、巨核系CHRF-288和Meg-01共4种细胞株后,提取胞浆蛋白和核蛋白,观察Daxx、Fas、NF-kb和c-Rel蛋白的表达水平,结果发现,三七皂苷某种程度上能够通过抑制Daxx、Fas蛋白表达,而相应减少细胞凋亡；同时也能通过增加NF-κB和c-Rel蛋白表达促进细胞增殖,并阻止半胱天冬酶连锁链的活化而抑制造血细胞凋亡,为应用于临床治疗凋亡过度的疾病(如再障)提供了可能性。
2.3 中药复方
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何氏等[22]研究扶正养营颗粒对免疫介导再障小鼠的作用机制,检测各组小鼠造血细胞凋亡以及相关调控蛋白Fas与Caspase-3的表达。研究表明,扶正养营颗粒能下调造血细胞表面基因蛋白Fas,并可抑制细胞凋亡过程中激活的关键激酶Caspase-3的活性,从而减少骨髓造血细胞凋亡的发生,改善骨髓造血功能,起到治疗慢性再障的作用。
刘氏等[23]观察炙甘草汤对再障模型小鼠骨髓造血细胞Caspease-3和人抗增殖细胞核抗原Ki-67的影响。结果发现,经炙甘草汤治疗的再障小鼠比模型组的再障小鼠Caspease-3明显降低,Ki-67表达明显升高,但各项指标在阳性对照药物康力龙的治疗组中无明显差别。说明炙甘草汤对再障小鼠造血细胞具有明显的保护和修复作用,对抑制细胞凋亡和促进细胞增生也有一定的作用。
3 临床研究
毕氏等[24]用补肾活血通络为主的愈障口服液治疗儿童慢性再障,观察临床疗效及治疗前后骨髓CD34+细胞原位凋亡情况。研究结果表明,治疗组骨髓CD34+细胞的凋亡率较治疗前明显降低,与对照组治疗后比较,差异有非常显著性意义(P<0.0l)。其作用机制可能是通过调节机体免疫功能,改善骨髓微环境或直接作用于骨髓CD34+细胞,抑制促凋亡因素或增加抗凋亡因素,以达到对儿童CAA骨髓CD34+细胞的调节、控制,从而使CAA患儿的骨髓造血功能重建。
刘氏等[25]以补肾活血通络法治疗再障,检测治疗前后再障患者T淋巴细胞亚群及血浆sFas、sFasL水平。结果表明,治疗前2组患者CD8细胞明显高于正常值,CD4/CD8比值明显低于正常值,治疗后治疗组CD8的下降程度和CD4/CD8的比值升高程度均较对照组显著(P<0.05)；治疗前2组患者血浆sFas水平比健康组明显减低(P<0.01),经补肾活血通络法治疗后,治疗组sFas水平较治疗前及对照组均明显增高(P<0.01)。据此推测,补肾活血通络法治疗CAA的作用机制可能是通过调整机体免疫功能,升高sFas水平,进而与Fas分子竞争结合FasL,阻断Fas介导的细胞凋亡。
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孙氏等[26]用补髓生血颗粒治疗再障并检测治疗前后骨髓造血细胞凋亡阳性指数及Bax基因表达阳性指数,结果表明,慢性再障患者骨髓细胞凋亡阳性指数及Bax基因表达阳性指数明显高于正常组,说明慢性再障患者骨髓造血细胞确实存在过度凋亡现象。经补髓生血颗粒治疗2个疗程后,肾阳虚型和肾阴虚型的细胞凋亡阳性指数和Bax基因表达阳性指数均较疗前明显下降,其中肾阳虚型患者细胞凋亡阳性指数趋于正常,但Bax基因表达水平仍高于正常组；肾阴虚型患者细胞凋亡阳性指数仍高于正常组,Bax水平亦高于正常。补髓生血颗粒对慢性再障患者有抑制造血细胞凋亡和下调Bax基因表达水平的作用,但这两种作用并不平行,说明降低Bax基因表达水平只是其抑制造血细胞过度凋亡的机制之一,Bax基因表达水平在治疗后仍难以降至正常,这可能是慢性再障难以根治的原因之一。
唐氏等[27]用参麦注射液联合SSL方案治疗CCA总有效率为63.6%,较对照组明显提高(P<0.01)。CCA患者血清TNF-α浓度、骨髓CD34+细胞凋亡率明显较健康人高(P<0.01)。经参麦注射液联合SSL方案治疗后,CAA患者血清TNF-α浓度、骨髓CD34+细胞凋亡率明显降低,与对照组比较有显著差异(P<0.05)。本研究表明,参麦注射液可能通过调节CAA患者免疫功能,抑制骨髓CD34+细胞凋亡来改善患者骨髓的造血功能,达到治疗慢性再障的作用。
4 小结
慢性再障属中医学“虚劳”、“血证”等范畴。1989年6月(大连),全国中西医结合血液病专业委员会第三届第二次学术会议拟定的肾阳虚、肾阴虚和肾阴阳两虚三型辨证标准,使再障的诊治水平产生飞跃,以补肾为主的方药治疗慢性再障已取得了较好的疗效[28-30]。中药治疗再障因其多靶点、多途径越来越受到学者们的关注。目前研究证实,中药可以改善骨髓造血微环境,促进骨髓造血,有改善再障患者免疫机制、对抗骨髓细胞凋亡等作用,同时可以减少西药的不良反应,提高患者整体状况。然而,研究多以补肾为主,中药复方为多,中药单体研究较之为少,多停留于检测骨髓CD34+细胞凋亡率,或者某种相关凋亡基因水平,中药对抗骨髓细胞凋亡的机制还尚不十分明确。从中药领域寻找治疗再障的特异性药物还需要一定时间,从临床治疗再障常用药物提取中药单体,以细胞凋亡路径为切入点,深入研究其作用机理,是今后研究的重点方向。
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