针对caspase?3基因的RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用

【摘要】  　　目的 探讨针对caspase?3基因的 RNA抑制对帕金森病细胞的抗凋亡作用。方法 NGF诱导PC12细胞为类神经细胞。细胞随机分为对照组、模型组、GFP siRNA组、caspase?3 siRNA组。对照组用完全培养液培养，其他3组细胞用6?羟基多巴胺制作帕金森病细胞模型。于制作模型前24 h进行转染。造模后对caspase?3及细胞凋亡率等指标进行检测。结果 （1）凋亡率：模型组细胞凋亡率〔（65.36±10.10）%〕明显高于对照组〔（5.00±1.00）%〕，有显著性差异(Ｐ<0.01)；caspase?3 siRNA组〔(19.00±4.08)％〕明显低于模型组(Ｐ<0.01)。（2）caspase?3阳性率:模型组的caspase?3阳性率〔(30.15±7.02)％〕明显高于对照组〔(8.20±2.45)％〕，差异有统计学意义(P<0.01)；caspase?3 siRNA 组caspase?3阳性率〔(12.00±2.90)％〕明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论 针对caspase?3的 siRNA能有效地抑制帕金森病细胞凋亡，对6?羟基多巴胺毒性作用下的神经细胞损伤有一定的保护作用。

【关键词】  帕金森病；RNA干扰；细胞凋亡

　　近年来研究表明，细胞凋亡在帕金森病的病理机制中起重要作用。细胞凋亡涉及多种基因的复杂变化，其中凋亡促进基因caspase?3与之关系密切〔1，2〕。基因干预可通过降低凋亡基因的表达而对细胞凋亡起到干预作用。本实验用6?羟基多巴胺作用于NGF诱导后的PC12细胞，建立帕金森病细胞模型，用RNA干扰(RNAi)方法对Fas基因表达进行抑制，从而观察该方法对帕金森病细胞凋亡的影响。

　　1  材料与方法

　　1.1  细胞培养和诱导 
 
　　PC12细胞于完全培养液（RPMI1640＋15％新生牛血清＋青霉素）中培养，每3 d换液1次，5～6 d传代1次。取对数生长期PC12细胞，消化、离心后用完全培养基重悬，密度为105/ml，待80％汇合时吸去旧的培养液，加入新培养液备用。成熟的PC12细胞接种于含有50 ng/ml（约2 nmol/L）NGF的完全DMEM培养液中，使细胞密度达到2.5×104～10×104/cm3，每2～3 d换液1次。约1 w左右形成神经纤维，并且持续培养10 d，成为类神经细胞。

　　1.2  实验分组及转染

　　将细胞分为完全培养液对照组、模型组、GFP siRNA组(绿色荧光蛋白基因干扰RNA组）；caspase?3 siRNA 组。细胞转染试剂由大连宝生物公司提供。将细胞接种于24孔培养板，48 h后细胞融合达46%～60%进行转染。每组设10个样本，转染24 h后，进行6?羟基多巴胺处理。

　　1.3  建立帕金森病细胞模型 

　　取NGF诱导后的PC12细胞，消化、离心后用完全培养基重悬，密度为105/ml，待80％汇合时吸去旧的培养液，加入新培养液备用。将模型组、GFP siRNA组、caspase?3 siRNA组细胞接种于162 cm2组织培养板中，待细胞贴壁成单层后，去上清，加入6?羟基多巴胺培养24 h后进行caspase?3表达及细胞凋亡相关检测。

　　1.4  caspase?3 siRNA序列 

　　caspase?3正义链：5′? GATCCCGTACCACTTGACATTATCGTTCTTGATATCCGGAACGATAATGTC
AAGTGGTATTTTTTCCAAA?3′,反义链：5′?AGCTTTTGGAAAAA
ATACCACTTGACATTATCGTTCTCTCTTGAAGAACGATAATGTC
AAGTGGTACGG?3′（试剂购自大连宝生物公司）。

　　1.5  TUNEL法检测细胞凋亡 

　　脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法（TUNEL） 用细胞凋亡试剂盒(罗氏公司) 。细胞用40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋、切片。步骤按细胞凋亡试剂盒说明书进行。结果判断：细胞核被染成棕黄色为阳性。 每张切片在400倍高倍视野下随机取20个视野，计数阳性细胞数。

　　1.6  流式细胞仪(FCM)分析

　　3 ml培养液含 5×105个细胞培养于6孔板,PBS液洗涤2遍，再用预冷的体积分数70%乙醇固定，4℃过夜，采用PI (50 mg/L)染色分析亚二倍体峰，分析细胞凋亡比例。重复实验10次。

　　1.7  FCM检测caspase?3表达

　　取细胞悬液(约1×106个/ml)，低速离心除去固定液，PBS洗2次。抗caspase?3抗体的标记采用间接荧光免疫法。将上述制备好的单细胞悬液用PBS洗2次，分别用加入1∶200稀释的特异性抗体50 μl，37℃水浴30 min，离心弃上清，加人1∶200稀释的FIFC?IgG 100 μl,37℃水浴30 min，离心弃上清，PBS洗1次以去除未结合的荧光抗体。上机前加人1 ml PBS，400目筛网过滤，上机分析。caspase?3蛋白表达量以平均荧光强度表示。

　　1.8  统计学方法 

　　计量资料描述采用x±s表示，用SPSS12.0对数据进行统计学处理。

　　2  结  果

　　2.1  TUNEL染色结果 

　　TUNEL染色显示凋亡的细胞核内有分布均匀的深蓝色颗粒，体积等于或小于正常胞核，凋亡细胞呈孤立、散在分布。再灌注后细胞凋亡数明显增加。对照组细胞凋亡数为(4.06±1.20)/视野，模型组为(72.80±25.20)/视野,两组间差异有统计学意义(P<0.01)。表明缺血再灌注可使神经细胞凋亡显著增加。GFP siRNA组为(69.10±20.24)/视野，与模型组相比，无显著差异。caspase?3 siRNA组细胞凋亡数为 (29.15±9.10)/视野，较模型组的神经细胞凋亡数明显减少(P<0.01)，提示抑制caspase?3可明显抑制6?羟基多巴胺所致的神经细胞凋亡。

　2.2  各组细胞凋亡率 

　　对照组的细胞凋亡率为（5.00±1.00）%，模型组为（65.36±10.10）%,caspase?3 siRNA组为（19.00±4.08）%，GFP siRNA组为（49.80±8.60）%。caspase?3 siRNA组与对照组、GFP siRNA 组的细胞凋亡指数相比有统计学意义(P<0.01)。而GFP siRNA组和对照组细胞凋亡指数相比无统计学意义。

　　2.3  各组caspase?3阳性率 

　　模型组的caspase?3阳性率〔(30.15±7.02)%〕明显高于对照组〔(8.20±2.45)%〕，差异有统计学意义(P<0.01)。GFP siRNA 组caspase?3阳性率〔(32.35±5.00)%〕明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，与模型组相比，差异无显著性。caspase?3 siRNA组caspase?3阳性率〔(12.00±2.90)%〕明显低于模型组、GFP siRNA组，差异有统计学意义(P<0.01)。

　　3  讨  论

    Fire等〔3〕首先在秀丽新小杆线虫中描述了RNA干扰，即与mRNA编码区同源的双链RNAi(double stranded RNA，dsRNA)诱导ｍRNA发生降解而引起的转录后水平基因沉默。外源性dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNAi(small interfering RNA，siRNA)与多种核酸酶形成了沉默复合物 (RNA?induced silencing complex,RISC)，RISC结合和切割mRNA介导RNA干扰的过程。RNAi具有高度的序列特异性和高效性〔4〕，是一种高度进化得以保存的机制，出现在多种真核细胞如：酵母、无脊椎动物、植物和脊椎动物〔5〕。

    细胞凋亡信号通道是一个复杂的网络系统，受多种细胞内外因素的调节，细胞内的各种caspase酶原激活反应也都参与凋亡信号的调节，其中caspase?3起着调往执行者的作用，其大量表达预示着细胞凋亡即将发生。对于凋亡信号通路可以用不同的方式、在几个关键部位被有效地抑制。利用RNAi技术，使凋亡信号通路上的蛋白质基因在转录后水平沉默，是人为实现调节凋亡信号最有效的策略之一。目前，已有文献报道在体内和体外研究调节细胞凋亡过程中，针对凋亡通路成员如：caspase?3〔6〕，caspase?8〔7〕或Fas〔8，9〕等的siRNA发挥了有效作用。

    本实验用RNAi技术对caspase?3基因表达进行抑制，从而对caspase?3介导的凋亡信号通路进行抑制，最终明显地抑制了细胞凋亡。本实验中模型组细胞凋亡率明显高于对照组，且caspase?3阳性率明显高于对照组，caspase?3 siRNA组细胞凋亡数及细胞凋亡率明显低于模型组，caspase?3阳性率也明显低于模型组。而GFP siRNA组样本各项参数与模型组相比均无明显差异。提示针对caspase?3的RNAi技术可有效地抑制caspase?3的表达及凋亡通路的激活、降低caspase?3的水平，从而降低细胞凋亡率。

    总之，针对caspase?3基因的RNAi技术可有效地抑制帕金森病细胞模型凋亡因子的表达，从而保护神经细胞免于凋亡。

【参考文献】
  　　1 Chen M，Wang J.Initiator caspases in apoptosis signaling pathways〔J〕. Apoptosis,2002；7(4):313?9.

　　2 White E.Life,death,and the pursuit of apoptosis〔J〕.Gene Dev,1996；10(1):1?15.

　　3 Fire A，Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature，1998；391(6669)：806?11.

　　4 Thakur A.RNA interference revolution〔J〕.Mol Biol Genet,2003；6(1):39?49.

　　5 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002；418:244?51.

　　6 Wurzer WJ，Planz O，Ehrhardt C,et al.Caspase?3 activation is essential for efficient influencenza virus propagation〔J〕.EMBO J,2003；22(11)：2717?28.

　　7 Zender L,Hutker S,Liedtke C,et al.Caspase? 8 small interfering RNA prevents acute liver failure in mice〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2003；100:7797?802.

　　8 Song E,Lee SK,Wang J,et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis〔J〕.Nat Med，2003；9：347?51.

　　9 Wang J,Li W,Min J,et al.Fas siRNA reduces apoptotic cell death of allogeneic?transplanted hepatocytes in mouse spleen〔J〕.Transplant Proc，2003；35(4)：1594?5.